自身免疫性甲状腺疾病(AITD)主要包括Graves’病(GD)和桥本甲状腺炎(HT)两种类型。两种疾病都受特定甲状腺自身抗原,如甲状腺过氧化物酶(TPO)甲状腺球蛋白(TG),和／或TSH受体(TSHR)的自身抗体(aAbs)的作用。GD和HT中的甲状腺功能亢进症／减退症可以视为AITD连续谱的两端,两种疾病在该连续谱中存在大量的重叠区间。不仅在几乎所有HT患者中TPOAb和／或TGAb滴度增高,而且在70%的GD患者中这两种抗体滴度也增高。甲状腺功能减退症源于长期慢性自身免疫性甲状腺炎,Graves’甲亢患者使用抗甲状腺药物进入缓解后最终有多达20%的患者转变为甲状腺功能减退症；阻断TSHRAb对于甲状腺功能减退症的发病贡献了三分之一,而慢性自身免疫性甲状腺炎贡献了其余的三分之二。甲状腺除了分泌甲状腺激素以外还能产生一系列免疫活性因子,如粘附分子、生长因子、炎症介质(一氧化氮和前列腺素),当然还有细胞因子。除了对靶细胞的生长和分化发挥关键作用以外,这些分子还调节许多甲状腺疾病的易感性。据报道,许多细胞因子,包括IL一1,IL一6,IL一8,IL一12,IL一13和IL-15由甲状腺细胞合成,其中IL-1可以刺激甲状腺细胞增殖并抑制甲状腺激素的合成和释放的几个步骤。它也刺激甲状腺产生其他细胞因子,如IL-6和IL-8,破坏甲状腺上皮屏障,并影响甲状腺细胞功能。实际上,IL-1下调甲状腺特异性蛋白,如Tg和TPO的表达,抑制碘化作用和Na+/I-同向转运体(NIS),并减少甲状腺激素向血循环的释放。IL-1家族由IL一1α, IL一1β,和IL-1受体拮抗剂(IL-1 Rα)组成。IL-1p主要由单核-巨噬细胞产生,它与IL-1α具有类似的结构和生物活性,是人类IL-1家族的主要成员。到目前为止,IL-1β在AITD中的病理生理学和诊断学意义仍然尚不明确。在本研究中,我们检测了HT,GD患者和正常对照组的血清IL-1β水平,发现并无统计差异。而外周血单个核细胞(PBMC)中,HT组IL-1β mRNA和蛋白水平均明显高于GD和正常对照组。此外,HT患者甲状腺组织的IL-1β mRNA水平也高于GD患者,这可能与HT患者的甲状腺组织局部浸润更多的的单核细胞也有关系。临床资料的相关分析证实了IL-1p的高表达与HT的发病机制相关。这些结果提示：IL-1p是参与桥本甲状腺炎发病机质的一个活跃的因子,可能会成为一种很有前途的诊断／治疗靶点。材料与方法：患者本研究纳入自2013年6月至2014年11月在安徽医科大学第一附属医院就诊的患者,其中新诊断的女性HT患者12例,年龄20至52岁(平均年龄37.58±9.29岁)；女性GD患者12例,年龄25至51岁(平均年龄37.92±9.89)；20名正常女性志愿者作为正常对照组,年龄18至50岁(平均年龄34.35±9.32岁)。血液样本和甲状腺组织切片采集采集患者和志愿者的外周血样本,转速200× g,4℃离心5分钟,收集上层血清并储存在-80℃冰箱中用于IL-1β的检测。使用标准Ficoll-Hypaque以密度离梯度方法离心分离获得PBMC,加入Trizol,储存于-80℃冰箱内用于提取总RNA。收集甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织标本,HT和GD的甲状腺组织标本储存在液氮中。免疫组织化学将石蜡包被的甲状腺组织制成5μm厚度的切片,使用二甲苯脱蜡。用微波方法30分钟作用于透明的切片完成抗原修复。以稀释的正常山羊血清封闭。用0.3%过氧化氢-甲醇处理切片,封闭内源性过氧化物酶。目标抗原使用1：100抗-CD14 (Abcam)或1：150抗-CD64(Abcam)孵育过夜用以检测。一抗标记过后使用带有辣根过氧化物酶的二抗(Santa Cruz Biotechnology)和3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐(Life Technologies)着色。切片使用苏木精复染色,然后清洗并固定。引物设计和反应条件根据Genbank序列,使用Primer Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物工程技术和服务公司合成引物。所有引物序列见正文表1。RNA的提取及cDNA的合成按照试剂盒制造商的说明书,使用Trizol (Ambion, Carlsbad, CA, USA)从PBMC和甲状腺组织中提取总RNA。使用逆转录试剂盒(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)合成cDNA.。所有RNA样本予65℃加热10分钟使得二级结构模板变性然后立即在冰上冷却5分钟。总RNA参照之前的文献报道进行逆转录。Real-time PCR分析使用Trizol从PBMC或甲状腺组织中提取总RNA。取1μg总RNA合成cDNA,按照试剂盒说明书步骤,分别加入各自引物及iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, USA),使用Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR系统(Life Technologies, USA)检测mRNA的表达水平。基因表达量用2-ΔΔct相对量表示。目的基因表达水平以β-actin作为内参进行标准化,结果以和内参相比较的循环数(Ct)差值来体现。血清IL-1p的Quantiglo ELISA测定按照试剂盒制造商的说明书(R&D Systems, Catalog Number QLBOOB, USA),采用Quantiglo ELISA方法测定血清IL-1p水平。所有样本均检测三次。化学发光法测定血清T3, T4, TSH, ATG和TPOAb按照试剂盒制造商的说明书(SIEMENS ADVIA Centaur XP Immunoassay System, USA)采用化学发光法测定血清T3,T4,TSH, ATG和TPOAb水平。所有样本均检测三次。放射免疫分析法测定血清TSHRAb按照试剂盒制造商的说明书(Union Medical Science & Technology Co., Ltd., Tianjin,China)采用放射免疫分析法测定血清TSHRAb水平。所有样本均检测三次。流式细胞检测分析采用BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization试剂盒(BD Biosciences, Oxford, UK)进行细胞预处理及染色。按照试剂盒说明书,细胞采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗-CD64抗体(BD Pharmingen)染色,然后使用藻红蛋白(PE)标记的抗-IL-1p抗体(BD Pharmingen)胞内染色。使用Beckman FC500流式细胞分析仪(Cytomics FC500,Beckman Coulter, Brea,CA, USA)检测待测细胞,获得的数据应用Beckman FC500CXP软件进行分析。统计学分析使用SPSS17.0 (SPSS,Chicago,IL,USA)软件对所有数据进行统计学分析。在正文及图表中,数据以均值土标准差(S.D.)的形式呈现。采用合适的Student’s t检验的方法比较组间配对的或非配对数据。对于非参数数据,采用Mann-Whitney检验分析组间差异。采用Pearson相关分析测试两个连续变量之间的相关性。p<0.05被视为具有统计学差异。结果HT组与GD组和正常对照组相比,PBMC中的IL-1β表达增高正如之前所述,目前认为多种促炎细胞因子参与了AITD的发病机制。我们采用qRT-PCR分析方法检测了AITD患者及正常对照PBMC中一系列Th1/Th2细胞因子以及IL-1p的mRNA水平。结果显示三组间IL-4, INF-γ, TNF-α和IL-13 mRNA水平无显著性差异,而HT组PBMC中的IL-1p的mRNA水平显著增高,几乎是GD组的3倍。而GD组PBMC中的IL-1p的mRNA又几乎是正常对照组的7倍。这意味着,两组AITD患者(GD和HT) PBMC中的IL-1β mRNA水平与正常对照相比均增高。此外,我们还检测了GD组、HT组和正常对照组PBMC中的IL-1p蛋白水平。PBMC细胞采用CD64和IL-1p双抗体染色,然后通过流式细胞术进行分析。HT组(n=9)PBMC中IL-1p/CD64的比例为67.17%～98.49%,明显比GD组(n=7)的23.19%-51.35%和正常对照组(n=8)的5.22%-18.42%高。此结果与之前的qPCR数据相吻合。这些结果显示：无论是在mRNA水平还是在蛋白水平,HT组PBMC中的IL-1β均明显高于GD组,而正常对照组PBMC中的IL-1β是最低的。HT组、GD组和正常对照组的血清IL-1p水平无显著性差异我们采用Quantiglo ELISA分析进一步检测了HT组(n=12),GD组(n=12)患者和正常对照组(n=20)血清中的IL-1β蛋白水平。与PBMC中所得到的数据不同,HT组,GD组和正常对照组血清IL-1β水平分别为0.47360±0.21313 pg/mL,0.46241±0.05170 pg/mL和0.52672±0.13024 pg/mL,三组间无显著性差异。HT组与GD组和正常对照组相比,甲状腺组织中的IL-1p表达量明显增高除了对PBMC中IL-1p的水平进行检测以外,我们还进一步采用qRT-PCR方法分析了HT、GD患者及甲状腺腺瘤患者(取腺瘤周围正常甲状腺组织)甲状腺组织中IL-1p的表达水平。与PBMC中的研究数据一致的是,研究结果显示：IL-1β mRNA在GD甲状腺组织中的水平几乎仅仅是HT甲状腺组织中的一半,而GD患者与甲状腺腺瘤患者之间甲状腺组织中的IL-1β mRNA水平无显著性差异。这一结果与Giordano C等采用免疫组化方法证实的HT患者甲状腺组织中IL-1p高水平表达的结果相一致。此外,我们还采用免疫组化分方法对于甲状腺组织中单核-巨噬细胞的浸润情况进行分析。IL-1p主要由单核-巨噬细胞产生,我们分别采用CD64和CD14抗体对单核-巨噬细胞进行免疫标记。HT患者甲状腺组织样本切片阳性染色细胞浸润明显超过了GD样本和甲状腺腺瘤周围正常甲状腺组织样本。IL-1p水平与HT组和GD组患者临床指标的相关性分析为了探索不同IL-1p水平在AITD患者中发挥的潜在作用,该分析招募了12名女性GD患者,12名女性HT患者,以及20名女性正常对照者。各组间在年龄分布上无显著性差异。各组间血清T3,T4,TSH, ATG以及TPOAb水平存在显著性差异(所有提到的指标,p<0.05),这与各组的诊断相映证。我们将每个组的数据分别单独分析,发现血清IL-1p水平以及PBMC IL-1β mRNA水平与这些血清学指标均无相关性。然而,将所有3组数据集中分析,发现PBMC IL-1β mRNA水平与血清ATG(r=0.711,p<0.001)及血清TPOAb(r=0.713,p<0.001)呈正相关。总之,本研究结果提示PBMC中的IL-1p水平与血清ATG及TPOAb水平呈正相关。结论我们的研究表明,IL-1β参与自身免疫性甲状腺疾病的发病,并且对桥本甲状腺炎的作用较Graves’病更为显著。