目的肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病;转染抗瘤相关细胞因子基因,是探索肿瘤基因治疗的重要领域。白细胞介素15（IL-15）是1994年发现的与IL-2有类似生物活性的细胞因子,可促进NK细胞和CTL细胞增殖并提高它们杀瘤活性。人体许多组织细胞都有IL-15mRNA表达但少有IL-15蛋白分泌,提示IL-15体内正常作用有可能主要是在细胞内发挥。已有报道将原型IL-15基因转染的肿瘤细胞植入裸鼠体内,并未获得理想的高效抗瘤效果,推测可能与原型IL-15基因自身长信号肽抑制其蛋白分泌有关。但转染能促进蛋白分泌的改型IL-15基因,也未取得预期效果。我们先前发现不同IL-15基因转染人小细胞肺癌细胞株NCI-H446肿瘤细胞,可明显降低其细胞的增殖速率,只是降低的程度彼此不尽一致。肿瘤细胞是由正常细胞突变而来,与其来源的正常组织细胞相比,细胞周期失控增殖速率加快是其主要恶性特征之一。迄今发现,细胞内影响细胞增殖速率的相关分子主要有:细胞周期正调控分子细胞周期蛋白（cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（CDK）及细胞周期负调控分子CDK抑制蛋白（CDKI）和某些抑癌基因编码蛋白。本研究用本室已成功构建的3种转染不同形式IL-15基因的NCI-H446细胞模型（转染原型IL-15基因的CIL-15、转染IL-15成熟肽基因的CIL-15mp和转染以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因的CIL-2sp-IL-15mp）作实验组,用野生型NCI-H446细胞（Cw）作对照组,研究不同形式IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响,以及对细胞周期正调控分子（cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4）和细胞周期负调控分子（p21和Rb）的蛋白及mRNA表达的影响,揭示其分子基础,为进一步探索IL-15基因的抗肿瘤作用提供有益的线索和启示。方法1以野生株NCI-H446细胞（CW）为对照组,用本室已构建的3种分别以不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞模型(原型IL-15基因转染的CIL-15、IL-15成熟肽基因转染的C_IL-15mp和以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因转染的CIL-2sp-_IL-15mp)为实验组,台盼蓝拒染法在连续8天的培养中每天计数活细胞,并绘制细胞生长曲线;MTT法检测培养24h、48h、72h和96h四个时间点的细胞增殖;流式细胞术分析细胞周期的变化。2以野生株NCI-H446细胞（C^W）为对照,检测3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞模型细胞(CIL-15、C_IL-15mp和CIL-2sp-_IL-15mp)中,细胞周期正调控分子cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的蛋白表达（Western-blot法）和mRNA表达（RT-PCR法）。3以野生株NCI-H446细胞（C^W）为对照,检测3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞模型细胞(CIL-15、C_IL-15mp和CIL-2sp-_IL-15mp)中,细胞周期负调控分子p21和Rb的蛋白表达（Western-blot法）和mRNA表达（RT-PCR法）。结果1不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响1.1细胞增殖台盼蓝拒染法的活细胞计数在培养后的第五天细胞计数分别为[（71.18±5.16）×104（C^w）]、[（58.93±3.34）×104 （CIL-15）]、[（35.82±2.45）×104 (C_IL-15mp)]和[（25.4±2.84）×104 (CIL-2sp-_IL-15mp)]。自培养后的第5天始至第8天,转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞生长速率均较野生株细胞增殖减慢且减慢的程度不同（P<0.05或P<0.01）;四种细胞的增殖速率由快至慢依次为C^w、CIL-15、C_IL-15mp、CIL-2sp-_IL-15mp。1.2细胞增殖的MTT测定72h培养时间点的OD值分别为1.124±0.091（C^w）、0.968±0.084 （CIL-15）、0.786±0.084 (C_IL-15mp)和0.627±0.156(CIL-2sp-_IL-15mp);96h培养时间点的OD值分别为1.564±0.163 （C^w）、1.262±0.135（CIL-15）、0.928±0.070 (C_IL-15mp)和0.777±0.030 (C IL-2sp-_IL-15mp)。在两个时间点中,3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞的OD值均较野生株细胞低,但程度不同（P<0.05或P<0.01）;四种细胞的OD值由高到低,依次为C^w、CIL-15、C_IL-15mp、CIL-2sp-_IL-15mp。2不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期的影响四种细胞G0/G1期的比例分别是（[69.44±3.26）%（C^w）], （[73.47±1.49）% (C_IL-15)], （[76.81±1.41）%(C_IL-15mp)]和（[81.26±2.31）%(C_{IL-2sp-IL-15mp})],彼此间都有显著性差异（P<0.05或P<0.01）; 3种转染IL-15基因的NCI-H446细胞G0/G1期的比例都显著高于野生株NCI-H446 G0/G1期的比例（P<0.05或P<0.01）。四种细胞G0/G1期细胞比例由高到低,依次为C_{IL-2sp-IL-15mp}、C_IL-15mp、C_IL-15、C^w。四种细胞S期的比例分别是[（26.90±1.43）%（C^w）]、[（19.94±1.72）%(C_IL-15)]、[（16.11±1.80）%(C_IL-15mp)]和[（12.80±0.59）%(C_{IL-2sp-IL-15mp})],彼此间都有显著性差异（P<0.05或P<0.01）; 3种转染IL-15基因的NCI-H446细胞S期的比例都显著低于野生株NCI-H446细胞S期的比例（均P<0.01）。四种细胞S期比例由低到高依次为C_{IL-2sp-IL-15mp}、C_IL-15mp、C_IL-15、C^w。3不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期正调控分子表达的影响3.1 cyclin D1的表达cyclin D1蛋白的表达分别是0.893±0.182 （C^w）、0.717±0.148 (C_IL-15)、0.749±0.172 (C_IL-15mp)和0.786±0.172 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞cyclin D1蛋白表达均与之无显著性差异（均P>0.05）;3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞间的表达也均无显著性差异（均P>0.05）。表明3种不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞cyclin D1的蛋白表达无影响。Cyclin D1mRNA的表达分别是0.52±0.046 （C^w）、0.47±0.125 (C_IL-15)、0.52±0.049 (C_IL-15mp)和0.54±0.057 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞cyclin D1mRNA表达均与之无显著性差异（均P>0.05）;3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞间的表达也均无显著性差异（均P>0.05）。表明3种不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞cyclin D1mRNA的表达无影响。3.2 cyclin E的表达cyclin E蛋白的表达分别为1.154±0.153 （C^w）、0.911±0.196(C_IL-15)、0.720±0.112 (C_IL-15mp)和0.531±0.104 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比, 3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp} )cyclin E蛋白的表达均降低（P<0.05, P<0.05,P<0.01）;且C_IL-15、C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}间,均有显著性差异（均P<0.05）。表明转染3种不同IL-15基因,均可以降低NCI-H446肿瘤细胞cyclin E蛋白的表达,但降低的程度不同。四种细胞cyclin E蛋白的表达量,由高到低依次为C^w、C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp}。转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞cyclin E蛋白表达的降低与G0/G1期细胞比例升高呈负相关（r=-0.983,P<0.01）,与S期细胞比例降低呈正相关（ r=0.993,P<0.01）。Cyclin E mRNA的表达分别是1.10±0.121 （C^w）、0.93±0.073 (C_IL-15)、0.76±0.059 (C_IL-15mp)和0.48±0.056 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp} )cyclin E mRNA的表达均降低（P<0.05, P<0.05,P<0.01）;且C_IL-15、C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}间,均有显著性差异（均P<0.05）。表明转染3种不同IL-15基因,均可以降低NCI-H446肿瘤细胞cyclin E mRNA的表达,但降低的程度不同。四种细胞cyclin E mRNA的表达量,由高到低依次为C^w、C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp}。转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞cyclin E mRNA表达的降低与G0/G1期细胞比例升高呈负相关（ r=-0.998,P<0.01）,与S期细胞比例降低呈正相关（ r=0.957,P<0.05）。3.3 CDK2的表达CDK2蛋白的表达分别是0.689±0.251 （C^w）、0.257±0.106 (C_IL-15)、0.254±0.120 (C_IL-15mp)和0.385±0.046 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp} )CDK2蛋白的表达均降低（P<0.01,P<0.01, P<0.05）;但C_IL-15、C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}间,无显著性差异（P>0.05）。表明转染3种不同IL-15基因,可同等程度地降低NCI-H446肿瘤细胞CDK2蛋白的表达。CDK2 mRNA的表达分别是0.964±0.139 （C^w）、0.560±0.167 (C_IL-15)、0.683±0.049 (C_IL-15mp)和0.622±0.023 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比, C_IL-15、C_IL-15mp、C_{IL-2sp-IL-15mp}的CDK2 mRNA表达均显著降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。在C_IL-15、C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}间,CDK2 mRNA的表达彼此无显著性差异（P>0.05）。表明转染3种不同IL-15基因,均可以同程度地降低NCI-H446肿瘤细胞CDK2mRNA的表达。3.4 CDK4的表达CDK4蛋白的表达分别是1.694±0.506（C^w）、1.067±0.338(C_IL-15)、1.038±0.311(C_IL-15mp)和0.974±0.255(C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,C_{IL-2sp-IL-15mp}的CDK4蛋白表达降低（P<0.05）,而C_IL-15和C_IL-15mp较之无显著性差异（均p>0.05）。C_IL-15、C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}间的CDK4蛋白表达无显著性差异（P>0.05）。表明改型IL-15基因的转染可轻度降低NCI-H446肿瘤细胞CDK4蛋白的表达,而原型或成熟肽基因的转染对NCI-H446肿瘤细胞CDK4蛋白的表达均无显著影响。CDK4 mRNA的表达分别是0.630±0.045（ C^w）、0.651±0.082( C_IL-15)、0.561±0.061 (C_IL-15mp)和0.666±0.027 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。四种细胞间CDK4 mRNA表达无显著性差异（P>0.05）,表明3种不同IL-15基因转染都不能显著影响NCI-H446肿瘤细胞CDK4 mRNA的表达。4不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期负调控分子表达的影响4.1 p21的表达p21蛋白的表达分别是0.907±0.042 （C^w）、1.052±0.086 (C_IL-15)、0.848±0.084 (C_IL-15mp)和0.878±0.050 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,C_IL-15的p21蛋白表达量增加（P<0.05）,C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}与之无显著性差异（均P>0.05）。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的p21蛋白表达;成熟肽基因或改型基因的转染,对NCI-H446肿瘤细胞的p21蛋白表达无显著影响。p21 mRNA的表达分别是0.455±0.051 （C^w）、0.747±0.061 (C_IL-15)、0.516±0.093 (C_IL-15mp)和0.512±0.117(C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,C_IL-15的p21 mRNA表达量增加（P<0.01）,C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}与之无显著性差异（均P>0.05）。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的p21 mRNA表达;成熟肽基因或改型基因的转染,对NCI-H446肿瘤细胞的p21 mRNA表达无显著影响。4.2 Rb的表达Rb蛋白的表达分别是0.860±0.184 （C^w）、1.132±0.150 (C_IL-15)、0.959±0.221 (C_IL-15mp)和0.938±0.091(C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,C_IL-15的Rb蛋白表达量增加（P<0.05）,C_IL-15mp和C_{IL-2sp-IL-15mp}与之无显著性差异（均P>0.05）。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的Rb蛋白的表达,而成熟肽基因转染或改型基因转染对NCI-H446肿瘤细胞的Rb蛋白表达无显著影响。Rb mRNA的表达分别是0.787±0.075 （C^w）、1.176±0.080 (C_IL-15)、0.899±0.103 (C_IL-15mp)和0.775±0.087 (C_{IL-2sp-IL-15mp})。与C^w相比,C_IL-15和C_IL-15mp的Rb mRNA表达量显著增加（均P<0.01）, C_{IL-2sp-IL-15mp}与之相比无显著性差异（P>0.05）。表明原型IL-15基因或成熟肽基因转染可增加NCI-H446细胞Rb mRNA的表达,而改型IL-15基因转染不影响NCI-H446细胞Rb mRNA的表达。结论1 3种不同IL-15基因转染可减慢NCI-H446肿瘤细胞增殖速率,减慢程度由高至低依次为C_{IL-2sp-IL-15mp}、C_IL-15mp、C_IL-15;减慢NCI-H446肿瘤细胞增殖速率与升高G0/G1期比例和降低S期比例有关。2 3种不同IL-15基因转染致NCI-H446肿瘤细胞增殖速率减慢和G0/G1期比例升高及S期比例降低,可能主要是由降低细胞周期正调控分子cyclin E的表达引起。3 3种不同IL-15基因转染致NCI-H446肿瘤细胞增殖速率减慢和G0/G1期比例升高及S期比例降低,主要不是由影响细胞周期负调控分子p21和Rb的表达引起。