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背景:绿脓杆菌肺炎是院内获得性肺炎中最常见的一种,肺泡性肺水肿是其病死率高的主要原因,而肺泡上皮细胞在肺泡水肿的发生及肺水的重吸收中都扮演着重要角色。有研究显示绿脓杆菌可以诱导肺泡上皮细胞发生凋亡,而绿脓菌素(PCN)是绿脓杆菌最重要的毒性代谢产物之一,那么是否也可以引起肺泡上皮细胞凋亡呢?如果发生凋亡,是通过哪种通路诱导的呢?本研究通过绿脓菌素刺激人类Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549细胞,观察在不同的毒素浓度和不同共培养时间下肺泡Ⅱ型上皮细胞活性及凋亡情况,并应用蛋白和核酸检测技术检测不同凋亡通路的重要生物学标记物,以进一步阐明绿脓杆菌引起的肺损伤的重要因素,以及发生凋亡的可能信号通路,从而为优化控制绿脓杆菌肺炎提供理论依据。目的:本研究试图通过观察在不同的毒素浓度和不同共培养时间下肺泡Ⅱ型上皮细胞活性及凋亡情况,分别应用MTT、流式细胞学及蛋白免疫印迹技术检测细胞凋亡情况,并应用qPCR从核酸水平检测蛋白表达情况。从而探讨PCN在诱导A549细胞凋亡的作用及其相关分子机制。方法:1.MTT方法检测所选取的不同浓度(5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml、50ug/ml)PCN对A549细胞活性的影响。2.根据MTT结果,选取25ug/ml的PCN做为实验浓度,分别刺激A549细胞6h、12h、24h,应用流式细胞术检测A549细胞凋亡、存活、坏死的比率。3.应用Western blot方法检测25ug/mlPCN刺激A549细胞0h、6h、12h、24h后,Caspase-3蛋白的表达情况。4.应用qPCR方法检测25ug/mlPCN刺激A549细胞0h、6h、12h、24h后,caspase-3、caspase-8、caspase-9 RNA表达的变化。结果:1.PCN刺激A549细胞浓度越高,刺激时间越长细胞活性越低,成剂量依赖、时间依赖关系。2.25ug/ml的PCN刺激A549细胞,于24h细胞凋亡比率增高,存活率降低,坏死比率无明显变化,均有统计学差异。3.25ug/mlPCN刺激A549细胞24h开始,表达的Caspase-3蛋白前明显体减少。4.25ug/mlPCN刺激A549细胞24h开始,表达的Caspase-3 RNA、caspase-9RNA转录明显增多,caspase-8 RNA无明显变化。结论:1.一定浓度的PCN刺激A549细胞一定时间,可以直接引起A549细胞的损伤,而这种损伤主要是由于引起了A549细胞的凋亡,而坏死不是主要原因。2.PCN刺激导致的A549细胞的凋亡通过Caspase-9蛋白通路(线粒体通路)引起,导致Caspase-3蛋白的活化增多,从而最终引起细胞的凋亡。本课题发现在绿脓杆菌肺炎中,绿脓杆菌分泌的绿脓菌素可以引起直接导致肺泡上皮细胞的损伤,这种损伤是由于直接导致了肺泡上皮细胞的凋亡引起,而这种凋亡是通过Caspase-9线粒体凋亡通路发生的。