流感属于急性呼吸道传染病,传染性强且发病率高。病毒的高度变异、频繁的全球性暴发与不确定的区域性流行严重威胁人类健康,全球每年由此造成的死亡人数高达25-30万人,同时给全球经济造成巨大损失。宿主感染流感病毒后会激发机体的免疫反应进而抵御和清除病毒感染。作为先天性免疫的组成部分,机体的免疫屏障,多种细胞因子、吞噬细胞、干扰素和干扰素刺激因子构成了抵御流感病毒的第一道屏障。在病毒感染过程中,当病毒被细胞模式识别受体识别后,触发先天免疫反应系统,这种识别使宿主产生适当的抗病毒反应,包括各种细胞因子的生成以及诱导炎性反应。A型流感病毒已进化出利用并破坏细胞蛋白或信号通路的策略,从而促进自身的复制。然而,目前对病毒的感染和复制过程、病毒与宿主因子的互作、宿主抗病毒免疫应答等的研究还不够深入,制约了特异有效的抗病毒药物的研发。另一方面,流感病毒在进化过程中也形成了多种策略逃避宿主的免疫监视从而可以有效的复制。了解流感病毒逃避宿主免疫反应的机制对病毒的防控,疫苗和抗病毒药物的研发有一定的指导作用。本研究筛选到了在人类细胞中复制能力不同的流感病毒毒株,对其病毒复制水平差异的分子机制进行了分析。另一方面利用高通量RNA测序的方法对流感病毒感染A549和293T细胞进行了转录组学分析,在此基础上,对差异表达基因IL-17A进行了抗流感病毒功能的探索。本研究主要分为两部分:第一部分:NS1蛋白关键氨基酸对流感病毒复制的影响。H5N1流感病毒作为造成畜禽感染的重要病原,也同样能感染人类。人类感染H5N1流感病毒后死亡率高达60%,该病毒对全球公共卫生具有严重的威胁。本研究利用前期筛选得到的三株流感病毒:2.3.4谱系的A/wild duck/Human/021/2005(HN021)和 A/chicken/Hunan/1/2009(HN01)以及 2.3.2.1c谱系的A/tiger/Jiangsu/01/2013(JS01))为模式病毒,利用3株H5N1流感病毒分别感染A549细胞和人外周血单核细胞分离得到巨噬细胞,收集特定时间点的细胞上清接种MDCK细胞,测定其半数感染量进而得到三株病毒分别感染A549细胞和巨噬细胞的生长曲线,通过生长曲线表明HN021和JS01可以在A549细胞和巨噬细胞中很好的复制,HN01病毒的复制能力较差。利用免疫荧光技术和Western blotting试验测定三株病毒分别感染A549细胞和巨噬细胞后的NP蛋白的表达量,进一步证实了 HN01病毒较弱的病毒复制能力。为了探索病毒差异性复制能力的原因,我们建立了测定模式识别受体、干扰素和其效应分子的荧光定量的方法,并利用该方法对三株病毒分别感染A549细胞和巨噬细胞后的样品进行检测。结果表明HN01病毒感染细胞后上调RIG-1,TNF-α,IFN-β,CCL-5,Mx1,GBP-1和CCL5的表达,而另外两株病毒却不能识别上述模式识别受体和诱导细胞因子的表达。结果表明HN021和JS01这两株H5N1流感病毒可以抑制细胞内干扰素及效应分子的表达,而HN01病毒不能抑制干扰素及效应分子的表达。三株病毒对宿主细胞诱导干扰素及其效应分子差异性的抑制作用是导致三株病毒差异性复制能力的原因。为了找到导致差异性的调节干扰素表达的分子基础,我们利用luciferase assay检测三株病毒NS 1蛋白调节IFN-β启动子活性的差异,结果表明在Sev病毒诱导下,HN01 NS1蛋白可以激活IFN-β启动子活性,而HN021和JS01 NS1蛋白却抑制了 IFN-β启动子的激活,表明HN01 NS1蛋白失去了抑制干扰素活性的功能。通过对三株病毒NS1蛋白序列比对,我们筛选到了 HN01病毒NS1蛋白潜在的三个氨基酸位点:K55、K66和C133。三个氨基酸位点同时突变(K55E、K66E和C133F)后的HN01 NS1蛋白可以显著的抑制IFN-β和ISRE启动子的活性。利用Western blotting检测病毒NS1蛋白发现三位点同时突变的NS1蛋白可以广泛的抑制细胞内基因的表达,同时对自身NS1蛋白的合成也有明显的抑制作用。同时,我们利用免疫共沉淀的方法对HN01 NS1蛋白及突变体与一系列宿主蛋白的结合能力进行了测定。结果显示HN01 NS1三个氨基酸位点同时突变后可以显著的增强其与CPSF30的结合,而对于包括TRIM25、PKR、NF90和PABII在内的已知的能够结合NS1蛋白的宿主蛋白的结合能力没有明显的变化。表明HN01 NS1蛋白主要通过调节与CPSF30的结合能力进而影响宿主细胞内的干扰素及效应分子的活性。最后我们利用HN01作为亲本病毒,构建了 NS1 K55E、K66E、C133F和三个位点同时突变的突变株病毒,亲本病毒和突变株病毒分别感染A549细胞和人巨噬细胞,结果发现C133F和三个位点同时突变的病毒在A549细胞和巨噬细胞中的复制滴度高于其野生病毒。结合其上,这些数据说明,H5N1亚型流感病毒不同毒株的NS1基因通过影响与CPSF30的结合能力限制宿主细胞内干扰素及效应分子的活性,进而可以影响病毒的复制能力。第二部分:宿主细胞因子对流感病毒复制的影响。RNA-seq作为全基因组分析的一种方法,已被广泛的应用于包括流感病毒在内多种病毒感染宿主细胞后测定细胞内转录组水平的变化。本研究利用流感病毒为模式病毒,两株H1N1病毒(CA04和PR8)和两株H5N1病毒分别感染A549和293T细胞并测定其在细胞内的复制能力,结果发现流感病毒在A549细胞中的复制水平远远高于在293T细胞中的复制,H1N1病毒差异倍数高达200倍。为了找到导致其差异性复制能力的分子基础,我们利用RNA-seq技术对流感病毒分别感染A549细胞和293T细胞进行了转录组学分析,通过对差异性表达基因进行分析发现,流感病毒感染的A549细胞中诱导先天免疫和炎症反应的信号通路被显著激活,细胞因子大量表达,与之相反,流感病毒感染的293T细胞中免疫信号弱,细胞因子低表达。我们以H1N1病毒为模型,分析发现流感病毒感染后的293T细胞富集到了 IL-17A的大量表达,提示我们IL-17A在调节炎性反应起到了一定的作用。为了进一步验证IL-17A在流感病毒感染中的作用,IL-17A体外孵育A549细胞进而感染PR8病毒,结果发现IL-17A可以促进PR8病毒对A549细胞的感染。同时我们利用IL-17A的基因敲除小鼠模式,利用PR8感染IL-17A基因敲除小鼠检测其对小鼠致病力的影响,结果表明IL-17A基因敲除小鼠相比对照组始终表现出体重下降和肺免疫病理学变弱等特征。这些结果揭示了流感病毒感染细胞的不同宿主反应以及IL-17A在调节病毒感染中的潜在作用。