肉苁蓉主要有补肾阳,益精血,润肠通便的功效。课题组在前期已经证实肉苁蓉总苷(以毛蕊花糖苷计含量为62.5%)是发挥拟雌激素作用的有效部位。基于前期工作基础,本课题拟通过构建“固有成分-雌激素活性”体外谱效研究模型,揭示肉苁蓉总苷发挥拟雌激素作用的物质基础。通过建立肉苁蓉总苷血清指纹图谱及含药血清的药效学考察,构建“固有成分-体内成分-雌激素活性”体内谱效研究模型,揭示肉苁蓉总苷发挥拟雌激素作用的直接作用物质。结合体内外谱效关系实验结果,揭示肉苁蓉总苷发挥拟雌激素作用的药效物质基础,并对揭示的药效物质基础进行药代动力学研究,揭示其发挥拟雌激素作用药效物质基础的体内过程。主要研究内容及结果如下:(1)采用正交设计法优化MTT的实验条件,选取的细胞为人乳腺癌细胞MCF-7,采用L9(33)正交实验设计,分别对铺板细胞数(A)、含药血清添加量(B)和含药血清作用时间(C)进行考察,优选最佳的实验条件。通过实验结果可知,各因素对MCF-7细胞的增殖影响程度依次为含药血清作用时间>含药血清添加量>铺板的最佳细胞数。综合直观分析与方差分析的结果,确定MCF-7细胞增殖的最佳因素组合是A2B3C2,即铺板的细胞数为1.5×104个/孔,含药血清添加量为5%,含药血清作用时间为72小时。并进行了验证实验,结果证明该方法稳定可行,具有良好重复性。(2)课题组前期采用UPLC/Q-TOF-MS技术对肉苁蓉总苷化学成分进行分析,并在其总离子流图中共标定出43个化合物,所以在课题组前期的工作基础上,通过MCF-7细胞增殖实验和小鼠子宫增重法,考察了肉苁蓉总苷的拟雌激素作用,并建立其与10个不同产地肉苁蓉总苷各特征峰之间关联性,对肉苁蓉总苷的谱效关系进行相关性分析,通过双变量相关分析法和灰色关联度分析法可知:有10个成分与“小鼠子宫增重”实验相关,有20个成分与“MCF-7细胞增殖”实验相关。(3)采用UPLC/Q-TOF-MS技术对肉苁蓉总苷体内成分进行成分分析,通过质谱解析及与课题组前期工作和文献报道对比,在其总离子流图中共标定出85个化合物,其中包括14个原型成分和71个代谢成分。(4)建立10个不同采血时间点的指纹图谱,共标定42个共有峰,且精密度、重复性、稳定性实验的相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于1%。分析10个不同时间点肉苁蓉总苷各共有峰与MCF-7细胞增殖之间的关联性,对肉苁蓉总苷的谱效关系进行相关性研究,通过双变量相关分析法和灰色关联度分析法可知:共有38个化学成分为肉苁蓉总苷发挥拟雌激素作用的体内直接作用物质。其中有19个成分与体外代谢有关联,分别为:8-表马钱酸、去甲基(2E,6Z)-8-0-β-D-glucopyranosy-loxy-2,6-dimethyl-2,6-octadienoic acid、甲基-O-红景天苷、甲基-O-京尼平苷、甲基-O-去咖啡酰基毛蕊花糖苷、丁香苷硫酸结合物、丁香苷葡糖醛酸结合物、乙酰化dehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucoside、dehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucoside、dehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-gluooside葡糖醛酸结合物、3,4-二羟基苯乙醇苷、羟基化芒柄花苷、甲基-O-crenatoside、去羟基化 crenatoside、去甲基化crenatoside、羟基化crenatoside、甲基化管花肉苁蓉苷B、巴尔蒂苷硫酸结合物、毛蕊花糖苷。(5)测定口服肉苁蓉总苷后大鼠体内丁香苷、毛蕊花糖苷、红景天苷和松果菊苷的含量测定方法,并进行代谢动力学研究。方法学考察结果表明,该方法专一性好、灵敏度高,精密度、稳定性、回收率、基质效应考察结果均符合生物样品测定的相关要求。代谢动力学结果表明,丁香苷、毛蕊花糖苷、红景天苷和松果菊苷在体内被迅速吸收,达峰时间分别为1.5h、1.0h、0.5h和1.0h,达峰浓度分别为123.79、96.28、99.30和110.52ng/mL,药时曲线下面积分别为 625.67、351.02、406.43 和 646.23 ng/mL*h,半衰期分别为1.88h、4.17h、5.11h和2.24h,通过药动学参数可以看出它们在体内代谢较快。综上所述,本研究揭示肉苁蓉总苷发挥拟雌激素作用的药效物质基础,并对揭示的药效物质基础进行药代动力学研究,揭示其发挥拟雌激素作用药效物质基础的体内过程,为后续肉苁蓉总苷的开发提供科学可靠的理论依据,同时为中药肉苁蓉深度开发为植物雌激素5类新药奠定基础。