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卵巢癌(Ovarian cancer,OC))是女性第四大恶性肿瘤、世界上第六大癌症,同时也是导致女性癌症死亡的第七大原因。在临床中,如果能够早期诊断卵巢癌,则临床治愈率会得到很大提高;但是,由于患者在其疾病早期阶段通常没有临床症状,因此给临床早期诊断带来很大难度。据统计,约80%的卵巢癌患者在早期发现并且治疗的话可以有90%的存活率,但对于卵巢癌III期和IV期的患者,其存活率急剧下降到不足30%。常规的盆腔检查、CA-125检查和超声检查等是卵巢癌的一般筛查方法,但其对诊断的参考价值较为有限。虽然有多种靶向药物已经用来治疗卵巢癌,但患者的整体生存率仍不理想。因此,探索卵巢癌发生、发展的机制对卵巢癌的诊断和临床治疗至关重要。白介素33(Interleukin 33,IL-33)于2005年被发现。它通过膜受体ST2发生的相关信号通路被认为能够激活丝裂原活化蛋白激酶和核因子(NF)-κB反应,最终导致体外T辅助细胞2极化型反应。关于IL-33在肿瘤发生中的机制研究近期被广大学者关注。多项研究表明IL-33在胆管癌、结肠癌、乳腺癌中都具有促进肿瘤进展的作用。IL-33已被确认为诊断或预测非小细胞肺癌预后的生物标志物。但也有研究显示IL-33对结肠癌有抗肿瘤作用,这些提示IL-33在肿瘤的发病机制中有复杂的作用。已有研究显示,在卵巢癌中发现IL-33和ST2水平升高,且IL-33通过下调p27、Fas和TRAILR1促进卵巢癌细胞增殖并抑制其凋亡,表明IL-33对卵巢癌具有显著的促癌作用。但是,其上游调控机制尚未完全阐明。双特异性MAP激酶磷酸酶(DUSPs)在近10年才被发现,是一类酶分子,可分为两类,非典型的双特异性磷酸酶和典型的双特异性磷酸酶。双特异性磷酸酶能够使酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化,激活细胞外信号调节激酶和氨基末端激酶。已有研究显示,目前多数家族成员均以丝裂原活化蛋白激酶的负向调节剂参与细胞分化、增殖、基因转录、代谢、细胞间通信等。如,双特异性MAP激酶磷酸酶(DUSP5)是抑癌基因p53的直接转录靶点,在多种类型的肿瘤中具有抑癌作用;DUSP5在前列腺癌和胃癌中表达下调,且DUSP5的表达缺失与不良预后有关;小鼠表皮DUSP5缺陷增加皮肤癌致癌物诱导模型中H-Ras驱动的乳头状瘤形成;在胃癌中,DUSP5的过表达降低了细胞核p-ERK水平,减缓了细胞生长;低DUSP5表达与结直肠癌不良预后有关。然而,DUSP5在卵巢癌发生进展中的作用尚未被报道。基于上述资料,IL-33在卵巢癌中高表达,而DUSP5能够抑制多种肿瘤的形成以及改善预后,我们提出假设:(1)DUSP5在卵巢癌中表达下调;(2)DUSP5能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;(3)DUSP5表达的下调能增强IL-33在卵巢癌细胞中的表达和分泌;(4)可通过上调DUSP5的表达来降低IL-33的水平,从而抑制卵巢癌细胞的生物学行为。综上,DUSP5能够通过调节IL-33的表达来影响卵巢癌的发生发展。本课题首先检测DUSP5在卵巢癌组织的表达情况及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响;其次研究DUSP5的低表达与IL-33表达和卵巢癌细胞生物学行为之间的关系,以及上调DUSP5后IL-33表达的变化和卵巢癌生物学行为的变化。第一部分卵巢癌组织中DUSP5的表达水平及其与预后的相关性研究目的:探讨双特异性MAP激酶磷酸酶5(DUSP5)在人卵巢癌组织、癌旁卵巢组织中的表达情况,并探讨DUSP5表达水平与临床预后的关系。方法:(1)收集2014年-2017年在苏州大学第一附属医院就诊的卵巢癌患者的组织标本;(2)统一对其进行实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)分析;(3)从Gene Expression Omnibus数据集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载DUSP5(NM＿004419.3)的表达模式,登录号为GSE49997,进行生存分析探讨DUSP5水平与临床预后的关系。(4)对60例卵巢癌组织芯片和15例癌旁卵巢组织标本进行免疫组织化学染色,进一步检测DUSP5在人卵巢癌组织和癌旁卵巢组织中的表达水平。为更客观,本部分采用组织化学评分法定量表达DUSP5的免疫组化染色程度。结果:(1)与癌旁卵巢组织相比,DUSP5在癌组织中的表达明显下调(P<0.001);(2)生存分析结果显示,DUSP5低表达的患者,其整体生存期缩短,HR=0.77(0.69-0.86),logrank P=4e-06;(3)通过组织化学评分法,将卵巢组织标本进行对比分析,结果显示15例癌旁组织标本的DUSP5均呈阳性,H值中位数为79.5;60例卵巢癌组织芯片中,有42份DUSP5染色较弱或未能检出,H评分在5-30之间。提示DUSP5在OC组织中的表达显著下调(P<0.001)。结论:卵巢癌组织中DUSP5呈低表达趋势,且DUSP5越低,患者的生存期限越短,提示DUSP5的低表达有潜力作为卵巢癌预后的参考指标。需通过较大样本进一步分析。第二部分DUSP5对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响目的:探讨DUSP5对卵巢癌细胞的生物学行为,如增殖、迁移和侵袭能力的影响,分析DUSP5在卵巢癌的生成和发展中的作用。方法:(1)通过定量聚合酶链反应(real-time PCR)和western blot方法,检测DUSP5在人类卵巢癌细胞株SK-OV-3和Cavo-3细胞系中的沉默效率;(2)用CCK8法检测DUSP5沉默对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖的影响;(3)用细胞划痕实验(Wound healing assay)和侵袭实验(Invasion assay)研究siRNA沉默DUSP5后,对SK-OV-3和Cavo-3细胞的迁移和侵袭能力的影响;(4)用定量聚合酶链反应(real-time PCR)和western blot法,验证DUSP5在人类卵巢癌细胞株SK-OV-3和Cavo-3细胞系中的过表达效率;(5)用CCK8法检测DUSP5的过度表达对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖的影响;(6)用细胞划痕实验(Wound healing assay)和侵袭实验(Invasion assay)研究过表达DUSP5后,对SK-OV-3和Cavo-3细胞系迁移和侵袭能力的影响;结果:(1)沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的增殖能力显著增加(P<0.05);(2)沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的迁移和侵袭能力明显增加(P<0.05);(3)过表达DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞的增殖能力受到显著抑制(P<0.05),但是细胞的迁移(P>0.05)和侵袭(P>0.05)能力无显著变化。结论:DUSP5能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但其作用的机制尚不明确,需要进一步的实验探索。第三部分DUSP5的表达下调对IL-33在卵巢癌细胞中的表达和分泌影响目的:探索人为干预致使DUSP5表达下调后,IL-33在SK-OV-3和Cavo-3细胞中的表达水平和分泌的变化。方法:(1)使用siRNA转染SK-OV-3和Cavo-3细胞,沉默DUSP5表达;转染实验包含4种处理类型:si-NC,si-DUSP5,oe-NC,oe-DUSP5;(2)用RT-PCR法检测DUSP5沉默前后SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33m RNA表达水平变化;(3)用酶联免疫吸附试验和蛋白印迹法检测沉默DUSP5前后,SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33的表达水平;(4)使用野生型IL-33启动子(pGL3-2.5k-luc)进行荧光素酶分析,探索DUSP5下调是否会诱导IL-33转录。结果:(1)沉默DUSP5显著增加IL-33的转录;(2)ELISA检测结果显示,沉默DUSP5后,SK-OV-3和Cavo-3细胞中IL-33的分泌量显著增加;(3)蛋白印迹法结果显示,沉默DUSP5后,SK-OV-3(P<0.001)和Cavo-3(P<0.001)细胞中前体IL-33和成熟IL-33的水平显著增加;(4)荧光素酶结果显示,下调DUSP5后,SK-OV-3(P<0.01)和Cavo-3(P<0.001)细胞中IL-33-Luc被激活,即IL-33启动子活性显著增强。结论:DUSP5的表达下调能够增强IL-33在卵巢癌中的表达和分泌,提示DUSP5可能是通过IL-33信号通路来影响卵巢癌的发生和发展,需要进一步实验来证实。第四部分DUSP5依赖于IL-33信号传导来抑制卵巢癌的发生和发展目的:进一步探索DUSP5和IL-33信号通路之间的关系,即抑制IL-33信号传导是否能够降低DUSP5抑制卵巢癌的生物学行为。方法:(1)用IL-33中和抗体(抗IL-33)处理SK-OV-3和Cavo-3细胞;(2)用CCK8法检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞增殖能力的影响;(3)用细胞划痕实验检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞迁移能力的影响;(4)用Transwell实验检测沉默DUSP5时,IL-33中和抗体对SK-OV-3和Cavo-3细胞侵袭能力的影响;(5)在野生型和DUSP5过表达的SK-OV-3和Cavo-3细胞中加入重组IL-33,然后用CCK8法、细胞划痕实验和Transwell法检测细胞的迁移能力和侵袭能力。结果:(1)CCK8结果显示,抗IL-33处理DUSP5沉默后的SK-OV-3和Cavo-3细胞,其抑制了沉默DUSP5增加的两组细胞增殖能力(P<0.05);(2)细胞划痕实验显示,抗IL-33处理SK-OV-3和Cavo-3细胞后,其抑制了沉默DUSP5对两组细胞的迁移能力(P<0.05);(3)Transwell实验结果显示,抗IL-33处理SK-OV-3和Cavo-3细胞后,其抑制了沉默DUSP5对两组细胞的侵袭能力(P<0.05);(4)CCK8结果显示,在DUSP5过表达细胞中,加入重组IL-33蛋白显著降低了DUSP5过表达抑制的细胞增殖作用(P<0.05)(5)细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,在野生型和DUSP5过表达的SK-OV-3和Cavo-3细胞中,加入重组IL-33蛋白显著促进了两组细胞的迁移能力(P<0.05)和侵袭能力(P<0.05)。结论:本部分实验提示IL-33具有明确的致癌作用,而且DUSP5抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能很大程度上依赖于对IL-33表达的转录抑制,即DUSP5通过调控IL-33信号通路来影响卵巢癌的发生和发展。