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目的:
通过研究Graves病(Gravesdisease，GD)患者外周血中miR-346表达水平的变化，分析miR-346与滤泡辅助性T淋巴细胞(follicularhelperTcell，Tfhcell)以及病人自身抗体水平的关系，初步探讨miR-346在Tfh细胞分化以及Graves病发病过程中的作用。
方法:
1.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测GD患者与健康对照外周血CD4+T细胞中Bcl-6mRNA表达情况。利用miRanda和PicTar两个数据库软件，预测可能调控Bcl-6的miRNAs，通过qRT-PCR检测这些miRNAs在GD患者以及健康对照CD4+T细胞中的表达情况，筛选出与Bcl-6mRNA表达趋势相反的miRNA做进一步研究。
2.利用荧光素酶报告实验验证miR-346与Bcl-6的靶向作用，明确miR-346与Bcl-63UTR的两个结合位点的作用强度。以表达Bcl-6的Jurkat细胞做为模型，转染miR-346mimics或NC，通过qRT-PCR检测转染后Jurkat细胞Bcl-6mRNA水平变化，Western-blot检测Jurkat细胞Bcl-6蛋白水平变化。
3.磁珠分选健康人外周血CD4+T细胞，转染miR-346mimics或NC，采用流式细胞术(flowcytometer,FCM)检测转染后CD4+T细胞中Tfh细胞(CD4+CXCR5+T)的比例变化。
4.采用qRT-PCR检测GD患者、治疗后GD组以及健康对照者的外周血CD4+T细胞以及血浆中成熟miR-346表达情况，并进行比较。
5.采用流式细胞术检测GD患者外周血中Tfh细胞(CD4+CXCR5+T)的比例，并与CD4+T细胞以及血浆中成熟miR-346表达水平进行相关性分析。同时对GD患者外周CD4+T细胞中miR-346表达水平与Bcl-6mRNA水平进行相关性分析。
6.应用化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay,CIA)检测GD患者的抗促甲状腺激素受体抗体(anti-TSHreceptorantibody,TR-Ab)、抗甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulinantibody,TG-Ab）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-thyroperoxidaseantibody,TPO-Ab）的水平，分析三种抗体水平分别与外周CD4+T细胞中miR-346表达水平的相关性。
结果:
1.GD患者外周血CD4+T细胞中Bcl-6mRNA水平显著升高(P＜0.05)。经过miRanda和PicTar两个数据库软件的分析，取预测结果的交集，并结合文献查询结果，筛选出可能调控Bcl-6的miRNA:miR-181d，miR-20a，miR-30b，miR-346。只有miR-346在GD患者外周血CD4+T细胞中表达显著下调(P＜0.05)，与上调的Bcl-6mRNA水平趋势相反。
2.荧光素酶报告实验证实，miR-346通过与Bcl-6的3UTR上第576-582位碱基及第893-899位碱基互补结合发挥抑制功能。miR-346单独作用于576-582位点时，荧光素酶活性下降约42％;单独作用于893-899位点时，荧光素酶活性下降约30％;同时作用于两位点时，荧光素酶活性下降约60％。Jurkat细胞（人白血病T细胞）自然状态下表达Bcl-6，过表达的miR-346能够从mRNA水平和蛋白水平抑制其Bcl-6的表达。
3.与转染NC组相比，人外周血CD4+T细胞过表达miR-346后，CD4+CXCR5+T细胞的比例明显下调。
4.与健康对照组相比，GD组外周血CD4+T细胞和血浆中miR-346表达水平明显下调(P＜0.001;P＜0.001)，治疗后GD组外周血CD4+T细胞和血浆中miR-346表达水平有所恢复。
5.GD患者CD4+T细胞中miR-346水平与CD4+CXCR5+T细胞的比例呈负相关(r=-0.4771，P=0.0334)，与Bcl-6mRNA水平也呈负相关（r=-0.4558，P=0.0434）。GD患者血浆miR-346水平与外周血中CD4+CXCR5+T细胞的比例有负相关趋势，但无统计学差异(r=-0.3322,P=0.1647)。
6.GD患者血清TR-Ab、TG-Ab和TPO-Ab水平分别与外周CD4+T细胞中miR-346表达水平呈负相关(r=-0.4086，P=0.0202;r=-0.4368，P=0.0227;r=-0.3533,P=0.0473)
结论:
1.通过生物信息学预测以及临床标本初筛，选出可能调控Tfh细胞主要转录因子Bcl-6的miRNA，miR-346;通过荧光素酶报告实验证实miR-346靶向作用于Bcl-6，主要作用位点是Bcl-63UTR上第576-582位碱基及第893-899位碱基;使Jurkat细胞过表达miR-346，证实miR-346能够从mRNA水平和蛋白水平抑制Bcl-6的表达。
2.体外实验证实，人外周CD4+T细胞过表达miR-346会引起CD4+CXCR5+T细胞的比例明显下调。GD患者外周血中miR-346表达下调，其水平与Tfh细胞(CD4+CXCR5+T)的比例呈负相关，与Bcl-6mRNA水平呈负相关，与患者血清TR-Ab、TG-Ab和TPO-Ab水平呈负相关。miR-346可能在GD的发病过程中起到了负向调控的作用。