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目的:通过建立人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs)修复葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型以及白喉毒素(diphtheria toxin,DT)诱导的巨噬细胞清除模型,明确巨噬细胞在huc MSCs修复IBD中的作用,探讨huc MSCs调控巨噬细胞修复IBD的作用机制,以提高huc MSCs治疗IBD的疗效。方法:1)将纯合子CD11b-DTR转基因小鼠进行配笼繁殖,使用聚合酶链式反应(PCR)技术和琼脂糖凝胶电泳技术筛选出纯合子小鼠用于后续实验。2)选取6周雄性CD11b-DTR转基因小鼠,预先饥饿24h后腹腔注射DT(给药浓度为25ng/g)以构建巨噬细胞清除模型。24h后提取小鼠腹腔巨噬细胞,进行F4/80、CD11b抗体染色,并使用流式细胞仪检测F4/80、CD11b双阳性细胞,分析其比率。3)选取6周、20g左右的雄性CD11b-DTR转基因小鼠,饮用含3%DSS的双蒸水以构建IBD模型。4)为探究巨噬细胞在IBD中的作用,将小鼠分为Ctrl、DT、DSS及DT+DSS组,DT于饮用3%DSS的前一天注射,每4天注射一次。每天称重小鼠体重并分析小鼠DAI指征,第10天左右处死,取结直肠及脾脏进行组织大体观观察,并留取组织标本以备病理及相关基因分析。采用H&E染色分析小鼠组织微观结构,qRT-PCR检测组织中炎症因子的表达水平。5)为探究巨噬细胞在huc MSCs修复IBD过程中的作用,将小鼠随机分为7组:Ctrl、DSS、DSS+DT、DSS+huc MSC、DSS+DT(day0)+huc MSC、DSS+DT(day3)+huc MSC和DSS+DT(day6)+huc MSC组,DT腹腔注射时间分别为实验的0、3、6天,每4天注射一次。3×106个的huc MSCs均于实验第3天进行腹腔注射,每隔3天注射一次。每天记录体重及分析DAI,于10天左右处死,取结直肠与脾脏观察组织大体观,提取组织并准备制备组织切片、提取蛋白及总RNA。运用H&E染色分析组织结构、免疫组化检测组织中PCNA的表达、q RT-PCR分析组织中炎性因子的表达水平以及western blot检测组织中caspase-3、PCNA和15-LOX-1等蛋白的表达水平。6)为明确huc MSCs是否通过调控巨噬细胞中15-LOX-1的表达来缓解IBD,将小鼠随机分为5组:Ctrl、DSS、GFP-DSS+huc MSC、15-LOX-1-DSS+huc MSC和15-LOX-1-DSS+DT+huc MSC组,1×109 PFU的GFP或15-LOX-1重组腺病毒分别于饮用含3%的DSS水前两天进行尾静脉注射。Huc MSCs注射方式同上。体重、DAI、组织大体观、组织结构、蛋白及总RNA检测同上。7)为探寻hucMSCs调节巨噬细胞15-LOX-1表达的关键分子,将数据库预测的能够靶向巨噬细胞15-LOX-1 m RNA 3’UTR的mi RNA与huc MSCs外泌体mi RNA测序结果交叉比对并筛选出重合mi RNA。将LPS刺激的RAW 264.7细胞与huc MSCs进行共培养,48h后运用q RT-PCR检测RAW 264.7细胞中筛选出的mi RNA表达水平。确定mi R-148b-5p为后续研究对象,设计mi R-148b-5p mimics、negative control和inhibitor分别转染huc MSCs以过表达或敲减huc MSCs中mi R-148b-5p。不同转染处理的huc MSCs与LPS刺激的RAW 264.7细胞共培养48h后,运用q RT-PCR检测RAW 264.7细胞中mi R-148b-5p、15-LOX-1 m RNA的表达水平,western blot检测RAW 264.7细胞中15-LOX-1的蛋白表达水平。8)为体内验证hucMSCs是通过mi R-148b-5p下调巨噬细胞15-LOX-1的表达以缓解IBD,将小鼠随机分为Ctrl、DSS、DSS+inhibitor-huc MSC、DSS+huc MSC和DSS+mimics-huc MSC组,分别使用mi R-148b-5p mimics、negative control和inhibitor转染处理的3×106个huc MSCs于实验第3天腹腔注射,间隔3天注射一次。体重、DAI、组织大体观、组织结构、蛋白及总RNA检测同上。结果:1)巨噬细胞清除模型建立成功。流式细胞术检测显示,DT处理后小鼠骨髓来源的巨噬细胞清除率达98.9%。2)与DSS组小鼠相比,巨噬细胞清除后,小鼠体重损失减轻但DAI降低;结直肠长度无差异但脾脏略缩小;小鼠结直肠与脾脏组织结构虽然仍然紊乱,但得到了一定程度的重建;同时,组织中炎症因子表达水平有所降低。3)与huc MSC单独处理小鼠相比,在huc MSCs注射前或当天将小鼠巨噬细胞清除后,huc MSCs未能缓解IBD小鼠体重损失、降低DAI、延长结直肠长度及缩小脾脏体积;丧失了组织结构重建能力;同时未能抑制组织中炎症因子水平、促进组织细胞再生。4)与GFP-DSS+huc MSC组小鼠相比,huc MSCs缓解15-LOX-1-DSS+huc MSC组小鼠IBD的能力有所下降,但差异并不明显。然而将15-LOX-1过表达IBD小鼠体内巨噬细胞清除后,huc MSCs丧失降低体重损失及DAI功能;未能恢复结直肠及脾脏尺寸和组织结构;同时也未能促进组织增殖能力及抑制炎症水平。因此,当huc MSCs能下调巨噬细胞15-LOX-1时,其在15-LOX-1过表达IBD小鼠中仍然发挥免疫调节功能;但当huc MSCs不能调节巨噬细胞15-LOX-1后,其将失去抑制炎症功能。5)RAW 264.7细胞与不同转染处理的huc MSCs共培养48h后,与对照huc MSCs相比,mi R-148b-5p mimics转染的huc MSCs能够明显提高RAW 264.7细胞mi R-148b-5p表达水平、抑制15-LOX-1 m RNA的含量。6)与对照huc MSCs相比,mi R-148b-5p inhibitor转染的huc MSCs失去了修复IBD小鼠体重损失、DAI、结直肠与脾脏大体和微观结构紊乱等功能;同时未能促进IBD小鼠组织中炎症因子及15-LOX-1水平降低、再生指标提高。但是huc MSCs过表达mi R-148b-5p后,其缓解IBD、抑制15-LOX-1表达功能增强。结论:Huc MSCs是通过mi R-148b-5p下调巨噬细胞15-LOX-1的表达水平从而缓解DSS诱导的IBD。