研究背景铅的用途十分广泛，在汽车、电池、印染、化工等领域具有重要地位。近年来，随着我国城市化和工业化进程的加快，生活环境中（冶炼废气、油漆、汽车尾气、玩具）铅含量水平增高，大大增加了人群的接触水平。慢性铅暴露的蓄积作用造成中枢神经系统功能不可逆损伤，具有流行范围广、毒性隐匿持久、损伤不可逆等特点。目前我国儿童平均血铅水平为80.7μg/L，约有10%～15%的城市儿童血铅超标；尤其是近年来，陕西凤翔县、广东清远、上海康桥、四川隆昌等地连续发生的环境铅污染和群体性儿童铅中毒事件，严重影响了儿童身心健康和社会安定。因此，当前儿童铅中毒的防治是我国政府和公众共同关注的环境健康问题和社会问题。慢性铅暴露可导致儿童脑功能的不可逆损伤，而作为中枢神经系统重要分支的视觉系统，慢性铅暴露导致发育期视觉功能的影响一直以来也是研究者关注的重点。流行病学调查发现，铅中毒可造成儿童弱视、视物不清，严重者可引发视野缺失、失明。但有关铅是如何进入视觉系统，以及其具体损伤机制目前尚不清楚。血视网膜屏障（blood-retina barrier，BRB）在正常情况下对于维持机体视觉系统内环境的相对稳定和独立性，保证其生理功能起着至关重要的作用，而BRB的破坏与几乎所有的视觉系统疾病都有着密切联系。本研究在人群调查发现儿童血铅水平与视觉功能异常相关的基础上，通过建立体内铅染毒动物模型，研究不同铅暴露水平对生长发育期大鼠BRB通透性的影响，探讨紧密连接（tight junction，TJ）相关蛋白及PI3K/Akt信号通路磷酸化修饰与BRB通透性变化之间的关系，为阐明铅诱导BRB通透性改变的可能机制提供理论依据。研究目的研究铅对BRB的影响及其分子机理，从BRB紧密连接蛋白表达调控的角度阐明铅损伤视觉功能的机理，为铅暴露导致视觉系统损伤的防治提供实验依据。研究方法1.血铅水平与视觉功能之间的关系以60名6-8岁儿童为研究对象，分析血铅与视网膜电图（electroretinograph，ERG）参数的关系。用原子吸收光谱法检测儿童血铅。采用Ganzfeld式视野刺激器（LKCTechnologies, Inc.），在暗室中记录铅暴露儿童暗适应ERG，闪光强度为0.01cd·s/m2，10-μs白光。2.铅染毒动物模型的建立通过给予3周龄的雄性SD大鼠自由饮用含0.1%、0.2%、0.3%醋酸铅的水溶液，对照组仅饮用去离子水，饮水6周，建立大鼠不同铅暴露水平模型。原子吸收光谱法测定大鼠血铅水平。3.铅对大鼠视网膜毒性作用研究采用RETI-scan系统视觉电生理检查仪，检测铅暴露大鼠ERG变化，观察铅对视网膜结构功能的影响；通过Hocest免疫荧光染色观察铅对视网膜结构的影响。4.血视网膜屏障通透性、完整性的检测伊文氏蓝静脉注射法，荧光显微镜观察铅暴露后BRB结构的完整性；硝酸镧示踪法，电镜观察BRB通透性变化以及TJ的结构变化。5.铅中毒后BRB紧密连接相关蛋白及PI3K/Akt等信号转导通路的变化Western blot方法检测视网膜内TJ相关蛋白和PI3K/Akt信号通路磷酸化修饰相关蛋白的表达变化情况，明确铅暴露后BRB通透性变化是否与TJ有关，结合PI3K/Akt信号通路抑制剂Wortmannin的作用观察了PI3K/Akt信号通路是否参与了铅诱导视网膜紧密连接开放，导致BRB通透性发生变化。研究结果1.铅对儿童视觉电生理的影响以血铅70μg/L为截断值，将观察对象分为低铅组、高铅组，分析比较两组间视网膜电图a波的振幅和潜伏期，未发现两组间差异具有统计学意义。分析比较两组间视网膜电图b波的振幅和潜伏期，结果表明高铅组b波波幅显著高于低铅组，而两组b波潜伏期差异无显著性。2.铅暴露对视网膜结构与功能的影响通过给予3周龄的雄性SD大鼠自由饮用含0.1%、0.2%、0.3%的醋酸铅水溶液，饮水6周后，各组（Con、0.1%、0.2%、0.3%）血铅浓度分别为24.9±5.8μg/L、226.2±5.8μg/L，284.2±35.4μg/L和330.3±52.3μg/L，表明血铅水平在我们的动物模型上呈剂量依赖关系，说明成功建立了大鼠铅暴露损伤模型。ERG检测结果显示铅暴露组Rod-ERG b波波幅与对照组相比，存在显著性差异（p<0.05），各组波幅值为229.81±24.36μv，357.12±56.58μv，489.42±73.54μv，530.13±48.42μv；而b波的波幅和潜伏期在Max-ERG，Ops，Cone-ERG和Flick-ERG均无显著性差异；通过Hoechst33342免疫荧光染色来检测铅暴露造成的视网膜组织结构改变，结果显示在铅暴露各组中视网膜的厚度均变薄，尤其是0.2%和0.3%组，视网膜的厚度大约是对照组的58%，进一步的分析显示，视网膜内网状层，内核层和外核层对铅损伤最敏感，可以观察到这些结构的厚度均显著减低，这些结果表明铅暴露可导致视网膜功能与结构的损伤。3.铅暴露对血-视网膜通透性的影响通过EB静脉注射，由荧光显微镜观察BRB结构的完整性，结果发现对照组视网膜各层结构中未发现EB渗出，铅暴露各组均可观察到EB渗出，其中0.2%和0.3%组荧光强度最高，内核层、外核层和视网膜神经节细胞层最为明显。硝酸镧示踪方法电镜观察显示在正常的视网膜组织中，脉络膜毛细血管腔内有大量的、连续分布的、致密的镧颗粒可以经过Bruch’s膜渗入到视网膜色素上皮细胞基底部皱褶内，但是镧颗粒不能通过脉络膜色素上皮细胞；而在大鼠铅暴露各组中均可观察到镧颗粒穿过脉络膜色素上皮细胞，且存在剂量依赖关系，0.3%组还可穿过脉络膜色素上皮细胞可到达外节，同时观察到紧密连接的开放。以上结果说明铅暴露可造成BRB完整性的破坏导致通透性增加，引起视网膜损伤。4.铅暴露对视网膜紧密连接和Akt磷酸化铅暴露后大鼠BRB紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5表达水平显著下降，与对照组相比，0.2%和0.3%组均存在显著性差异（p<0.01）；P-Akt定量结果显示，Thr308位点免疫阳性强度无明显差异，Ser473位点免疫阳性强度随暴露剂量依次升高，与对照组相比，均存在显著性差异（p<0.01），表明染铅后BRB开放可能与紧密连接的表达和Akt磷酸化有关。5.PI3K/Akt信号通路参与了铅暴露后BRB开放的调控通过PI3K/Akt通路抑制剂Wortmannin与铅共作用（0.3%组）观察其对BRB的影响，结果显示：给予Wortmannin可降低Rod-ERG的b波波幅21%，表明Wortmannin可能部分恢复视觉功能；形态学观察给予Wortmannin减轻EB渗出，镧颗粒通过色素上皮细胞程度减轻，同时Wortmannin可以提高Occludin，Claudin-5的表达水平，程度分别为29%、16%，表明Wortmannin可减轻铅诱导的BRB通透性变化；给予Wortmannin干预可以显著降低视网膜组织内p-Akt(Ser473)的磷酸化水平，存在显著性差异（p <0.01），表明Akt磷酸化可能参与了铅诱导的BRB通透性的变化。研究结论综上所述，本研究观察到铅暴露与儿童视网膜电图b波改变相关，铅暴露可导致视网膜功能与结构的损伤，这种损伤与BRB完整性的破坏和通透性增加有关，PI3K/Akt通路所调控的紧密连接蛋白表达变化可能是铅损伤BRB的分子机制。