新兴的纳米科技可以极大地改变目前的医疗现状,可解决许多医学难题,提供有针对性的医学诊断和治疗。量子点(QDs)作为常用纳米材料之一,独特的光学性质不仅能保证其荧光强度长期稳定,而且能够同时检测多个信号。但是,若要将量子点应用于生物医学,尤其是临床医学领域,我们需要充分了解其生物安全性,因此,深入探讨量子点的毒性、毒作用机制及生物安全性评价就变得至关重要。关于量子点毒性效应的研究已有多篇报道,但是与中枢神经系统相关的毒理学研究资料却十分匮乏。鉴于量子点能够在神经科学的基础研究和神经系统相关疾病的诊断和治疗中起到重要作用,对其进行全面而深入的神经毒性研究就显得十分迫切和必要。本论文主要探讨量子点对大鼠海马体的神经毒性,结合本课题组长期以来对巯基丙酸(MPA)修饰的CdTe量子点已经进行的肝毒性、肾毒性、呼吸毒性等的毒理学研究结果,以及生物医学领域的实际应用情况,从基因、分子、细胞、器官、模式生物、整体动物的不同研究水平,探索了 CdTe量子点可能导致大鼠海马体发生的毒性作用,以及导致这些毒性作用可能的作用机制。具体的研究内容分为以下四个部分:1.CdTe量子点的制备与表征。应用电化学方法合成高质量的水溶性MPA修饰的CdTe量子点,通过透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见光分光光度仪(UV-visible light spectrophotometry)、荧光分光光度仪(fluorescence spectrophotometry)、X-射线衍射仪(X-ray diffractometer)和 Malvern 粒径分析仪(Malvern size analyzer)等对量子点进行表征分析。2.探讨CdTe量子点对模式生物--秀丽隐杆线虫(以下简称秀丽线虫或线虫)的神经毒性作用。以秀丽隐杆线虫作为模式生物,研究CdTe量子点对其运动行为、摄食行为、学习记忆等神经系统相关行为学的影响,在此基础上进一步研究CdTe量子点导致这些毒性效应可能参与的在基因水平上的神经递质传导和接收途径。3.研究CdTe量子点对原代培养的大鼠海马神经元的毒性作用机制。以原代培养的大鼠海马神经元为体外研究模型,研究CdTe量子点对神经元活性、凋亡发生、细胞内活性氧生成和胞内钙平衡的影响,以及存在的剂量-效应关系。根据量子点的特殊理化性质,分析了不同粒径的CdTe量子点导致的细胞毒性效应间的差异。具体从神经电生理角度分析了 CdTe量子点导致神经元胞内钙水平升高的作用机制。4.研究CdTe量子点对大鼠海马体的神经毒性作用。给予Wistar大鼠一定剂量的CdTe量子点,观察对其学习记忆能力的影响,并从大鼠的血液生化和组织病理学结果找寻量子点造成这些行为学损伤的原因;再通过全转录组测序更为深入而全面地研究CdTe量子点对大鼠海马体造成的毒性效应,以及参与的分子作用机制和靶点;并根据转录组测序数据进一步深入研究CdTe量子点参与的三条主要分子信号通路——与学习记忆能力相关的PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路、以及与炎症反应相关的NF-κB信号通路。取得的主要研究结果如下:1.量子点的制备和表征:本研究所用水溶性MPA修饰的CdTe量子点是通过完善而成熟的电化学方法制备合成。通过水浴低温反应2 h和20 h分别制备获得了平均直径为2.2 nm和3.5 nm的CdTe量子点,分别发射绿色和红色荧光。经各种理化检测发现,制备的CdTe量子点光学性能良好,荧光强度至少可保持四周不变。电镜结果显示量子点呈球形、颗粒分散均匀、稳定性良好。两种量子点在细胞培养液中均带负电。表明制备的水溶性MPA修饰的CdTe量子点达到设计标准,可满足本研究的所有实验要求。2.秀丽线虫研究表明:CdTe量子点暴露可以损伤秀丽线虫的运动行为、摄食能力、化学趋向性学习能力和温度趋向性记忆能力,并且量子点暴露72 h造成的毒性效应比24 h明显(P<0.05)。而这些毒性效应发生的原因与CdTe量子点可以影响编码神经递质谷氨酸、五羟色胺和多巴胺转运蛋白和受体的基因表达量有关。此外,CdTe量子点暴露的线虫体内ROS生成量的显著增加,可见量子点导致的氧化应激与染毒线虫表现出的神经行为毒性反应也密切相关。但是,由于生物体神经传导的复杂性和相关基因的多元性,CdTe量子点对生物体神经系统可能造成的毒性效应以及毒作用机制需要用动物实验进行验证。3.体外研究表明:CdTe量子点可以显著降低原代培养的大鼠海马神经元的细胞活性,促进其凋亡,具有明显的剂量-效应关系。这些毒性效应的发生可能是由于CdTe量子点促进神经元胞内ROS过量生成,从而造成细胞氧化应激损伤和胞内钙失衡导致的。我们通过抗氧化剂NAC验证了 ROS过量产生是CdTe量子点造成细胞毒性的作用机制之一。而对于作用机制更为复杂的细胞内钙水平升高,除了可以通过CdTe量子点造成的氧化应激反应来解释,还通过神经电生理学经典的膜片钳技术进一步进行了探索。结果表明,CdTe量子点增加了细胞膜上被激活的HVA钙通道的数量,同时抑制其失活,从而促进钙离子从胞外流向胞内。CdTe量子点还可以增加钠通道的电流幅度,加速钠通道的激活和失活,减缓了其失活后恢复,通过细胞膜上钙钠交换活动,间接促进胞外钙离子内流,而神经元内严重的钙稳态失衡将不可避免地造成神经元损伤。但是,基于体外培养细胞的毒理学实验结果的说服力仍然不够,还需用CdTe量子点对活体动物的神经系统毒性效应进行研究。4.体内研究表明:用大鼠海马体在体注射CdTe量子点的方法,模拟量子点定向给药,并使得CdTe量子点在大鼠海马体成功聚集。该染毒方式避免了量子点结合的生物分子可能对其生物效应的影响,选择了与前期研究同样的CdTe量子点,保证了整个实验的连贯性。CdTe量子点暴露可以导致大鼠的学习效率和空间记忆能力出现一定的损伤,这可能与在大脑海马区观察到的病理学变化以及神经元和突触连接上超微结构的变化有关。通过全转录组测序技术获得了CdTe量子点造成神经毒性可能作用的靶点基因。根据这些调控基因提供的生物学信息,进一步完善分析了 CdTe量子点造成海马体毒性效应参与的Toll样受体信号通路的作用机制。表明CdTe量子点暴露可以通过抑制PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路的关键生物分子蛋白AKT和ERK1/2的磷酸化,直接或间接下调核蛋白c-FOS表达,损伤突触可塑性,抑制LTP的形成,从而影响大鼠的学习记忆活动。此外,CdTe量子点还可以激活中枢神经系统中的免疫细胞——小胶质细胞中的MyD88/TLR2/NF-KB信号通路和NLRP3炎症小体,导致小胶质细胞分泌促炎性因子IL-1β增加,诱发炎症反应。鉴于目前有关量子点神经毒性的研究十分有限,本论文旨在揭示CdTe量子点对大鼠海马体的生物效应和参与的毒性作用途径。本论文不但明确了 CdTe 量子点对体外海马神经元和小胶质细胞以及模式生物神经系统和大鼠海马体的毒性效应,并验证了 CdTe量子点造成这些毒作用参与的途径,例如ROS生成、神经传导损伤等。此外,还用分子生物学实验方法对CdTe量子点毒性效应可能参与的Toll样受体信号通路进行了较完整的研究。我们希望本研究的一系列指标可以作为毒理学观察终点来评价量子点的神经毒性,并能够为后续量子点更为深入的神经毒性的研究提供有价值的参考。