论文部分内容阅读
十字花科作物是农业生产中最重要的作物种类之一,在生产上广泛利用雄性不育系生产其一代杂种。对雄性不育机理的研究可以了解小孢子的发育机制,理解花粉发育的进程,还可以为人工创造雄性不育系提供理论依据,在生产实践和理论上都具有十分重要的意义。我们实验室采用cDNA-AFLP技术从白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino）减数分裂胞质分裂突变体mmc （male meiotic cytokinesis）的野生型（可育株）中分离到两个与花粉育性密切相关的差异片段,其中一个与花粉外壁蛋白（pollen coat protein,PCP）基因高度同源,另一个与植物多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）基因序列相似性较高。早期的研究表明,这两个差异片段在mmc突变体的野生型中蕾、大蕾和开放花中特异表达,在mmc突变体（不育株）中完全不表达,表明这两个差异片段是属于决定花粉育性的晚期表达基因,但其确切的生物学功能还不清楚。在本研究中,我们拟通过构建其反义和RNA干涉载体转基因的方法,对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino var. parachinensis （Bailey） Tsen et Leel进行转化,以获得这两个基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能。获得的主要结果如下: （1）在已有cDNA-AFLP差异片段的基础上,利用RACE技术获得花粉发育相关的PCP基因BcMF5利PG基因BcMF6的cDNA和DNA序列全长。序列分析表明,BcMF5基因的cDNA序列全长的最大ORF框为252bp,其DNA序列全长含有1个长度为268-bp的内含子。同源分析表明BcMF5基因属于PCP-A基因家族的成员,与SLR1-BP基因的同源性最高,具有PCP的典型结构特征,在花粉和柱头互作及自交不亲和反应的花粉识别中起作用。BcMF6基因的cDNA序列全长的最大ORF框为1194bp,其DNA序列全长包含3个内含子和4个外显子,内含子的长度依次为81bp、95bp和127bp,序列分析表明其含有一PG活性位点(227RVTCGPGHGIS.IGS240),同源比对和系统树构建表明,BcMF6基因属于花粉发育过程中特异表达的PG基因。 （2）构建了BcMF5基因含有组成型启动子CaMV35S的RNA干涉载体pBI35S-RMF5和含有绒毡层特异表达启动子A9、BcA9的RNA干涉载体pBIA9-RMF5和pBIBcA9-RMF5。并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF5基因RNA干涉表达载体导入菜心中,获得了BcMF5基因干涉载体的菜心转基因植株。 （3）构建了BcMF6基因含有组成型启动子CaMV35S的反义载体pBI35S-AMF6和含有绒毡层特异表达启动子A9、BcA9的反义RNA载体pBIA9-AMF6和pBIBcA9-AMF6。并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF6基因反义RNA表达载体导入菜心中,获得了BcMF6基因反义载体的菜心转基因植株。