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胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃、十二指肠内容物反流至食管而出现烧心、反酸、暖气、胸骨后灼痛等症状的一类疾病，反流性食管炎(Refluxesophagitis,RE)是其中的一种类型。目前西医对GERD的治疗主要是药物和手术治疗。西医药物治疗的缺点是容易复发，维持治疗方案不成熟，疗程难确定，不良反应大。手术方法因其并发症、后遗症使之推广受到限制。因而寻找新的替代疗法显得意义重大。
骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSC)移植作为近年新兴的生物学疗法，受到了广泛重视。具有免疫原性小、无药物毒副作用、易于获取和扩增的优点。研究表明，在大鼠食管肌层注射干细胞有助于治疗GERD,然而就RE模型来说，BMMSC是否能自然地循环到食管损伤区域并重建损伤的食管粘膜，依然有待研究。
已有研究证实，干细胞的分化取决于它所存在的微环境。因此我们设想:海巴戟天莘取物(MorindacitrifoliaExtract,MCE)或许能通过其自身抗炎抗氧化等作用改善GERD相关的食管炎症，为干细胞向正确方向分化创造更加有利的微环境，促使其更多地向食管正常上皮细胞分化，而非向柱状上皮分化，从而起到延缓巴雷特食管(Barrett esophagus,BE)甚至延缓食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)的作用。
因此，选择MCE联合BMMSC移植治疗GERD,评价它们对GERD的治疗作用能否出现协同效应，并评价其对BMMSC分化的影响。如能减少柱状上皮分化，则有助于提升干细胞移植的安全性，为MCE联合干细胞移植治疗GERD提供相应的理论依据，最终为其临床应用奠定基础和积累经验。本课题共分为三部分研究内容:
第一部分:胃食管反流病大鼠模型的比较研究
目的:评价多种大鼠GERD模型对于药物干预的敏感性以及肠上皮分化发生率。
方法:比较不同时间间隔下外源性酸化胃蛋白酶(Acidified pepsin,AP)灌注模型、三种手术方式食管胃空肠吻合术(Esophagogastricjejunostomy,EGJ)、食管空肠吻合术(Esophageal jejunostomy,EJ)、食管空肠吻合术合并胃切除术(Esophageal jejunostomy and Gastrectomy,EJ/TG)o构建模型成功后的宏观评分，包括充血，水肿，糜烂，溃疡，壁内或腔内出血;HE染色后进行微观评分，包括上皮丢失(分离、糜烂、溃疡)、反应性上皮变化(基底增生、乳头状瘤、有丝分裂、原位角化、角化不全)、血管改变(包括充血、水肿、出血、血管病变)、炎症(炎性细胞聚集和弥散);采用pH电极测定食管下段pH值;超声测定粘膜下血流;采用免疫组织化学方法用抗Ki-67研究粘膜基底细胞增殖;免疫组织化学研究尾侧型同源转录因子2(Caudal-related homeobox transcription factor2,CDX2)、三叶因子1(Trefoil factorl,TFF1).三叶因子2(Trefoil factor％TFF2)的表达。在多种模型中评价宏微观评分在确定性疗效药物治疗后的改善值，评价各种模型对药物干预的敏感性。评价各种造模方法中对柱状上皮化生和不典型增生的影响。
结果:AP灌注构建的模型中，采用45min/bid.持续5d的方案构建的模型包含炎症、糜烂和溃疡等改变，但维持了上皮和一定程度的上皮反应性改变。所有AP灌注构建的模型都没有观察到的柱状上皮化生。AP灌注模型中60min/bid.持续3d和45min/bid.持续5d的造模方案对于药物干预的敏感性要高于手术构建的GERD模型。在手术造模方式中，EGJ术式与其他术式相比，柱状上皮化生率最高，达到39.4％。
结论:外源性AP灌注方案和手术造模方案均可以用于评价药物的有效性。外源性AP灌注45min/bid.持续5d的方案构建的模型对药物干预的敏感性最高，适用于评价MCE联合BMMSC的治疗效果。内源性EGJ手术方式造模促成柱状上皮化生的比例最高，适合研究MCE对BMMSC在食管微环境下分化的影响。
第二部分:MCE促进BMMSC向食管上皮分化的作用及机制
目的:研究BMMSC能否在与食管上皮细胞(Esophageal epithelial cell,EEC)共培养条件向食管上皮分化，并且研究这种分化是否与Wnt/p-catenin信号通路有关，进一步研究MCE对这种分化作用的影响及其作用机制。
方法:将大鼠BMMSC和EEC共培养，使用无直接接触的transwell培养系统将BMMSC与EEC共同培养，并检测EEC的表面标记Pan-CK在BMMSC中的表达。与EEC共培养后，采用Western Blot检测BMMSC中Wnt/p-catenin信号通路的主要成员GSK-3。和p-catenin含量。在BMMSC培养系统中加入Wnt/0-catenin信号激活剂氯化锂，Western Blot检测其对磷酸化的GSK-3R和伊catenin的影响，免疫细胞化学染色检查其对Pan-CK表达量的影响。制备出MCE,高效液相色谱分析鉴定其有效成分。将MCE用于三种情况:与EEC共培养的BMMSC、诱导角化培养基中的BMMSC、普通培养基独立培养的BMMSC,研究MCE对促进BMMSC向上皮分化的作用以及机制。商用试剂盒检测MCE细胞毒性，ELISA检测共培养系统中EGF,细胞化学染色检查上皮分化标记物Pan-CK,qRT-PCR检测MCE对上述三种情况中CK18、CK19、EMA、Wnt3a、p-catenin、EGF、CDX2等基因表达的影响。Western Blot检测MCE对Wnt/p-catenin信号通路相关的Akt和GSK3p的磷酸化水平。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测P-catenin的核内移和转录活性的影响。并且分别加入Wnt抑制剂Dkk-1或PI3K抑制剂LY294002,对比上述检测标的。
结果:与EEC共培养的BMMSC能获得EEC的表型，其内Wnt/0-catenin信号通路的主要成员磷酸化GSK-30和0-catenin增加，通路激活剂氯化锂可增加磷酸化GSK-3β和β-catenin的表达，并增强Pan-CK的表达。说明Wnt/β-catenin信号通路的激活促进了BMMSC上皮分化。MCE有效成分被鉴定为山奈酚-3-O-芸香昔和芦丁两个化合物。MCE未显示出细胞毒性，0.0038％(w/v％)浓度即可提高共培养系统中EGF含量，增强上皮分化标记物Pan-CK细胞中表达，上调CK18、CK19、EMA、Wnt3a、β-catenin、EGF对应基因的表达水平，但对肠源性的CDX2基因无影响。在Wnt/β-catenmfs号通路中，MCE会增加Akt和GSK3β的磷酸化水平以及P-catenin的核转运和转录活性，这些作用会因加入Wnt抑制剂Dkk-1或PI3K抑制剂LY294002而减弱。
结论:与EEC共同培养可以通过激活Wnt/p-catenin通路促进BMMSC的上皮样分化。最小有效剂量为0.0038％(w/v％)的MCE可以通过促进EGF分泌，以及Wnt/p-catenin信号通路的PI3K/Akt依赖性激活增强BMMSC的上皮分化。MCE联合BMMSC移植可能成为修复GERD食管损伤的新型治疗方案。
第三部分:MCE改善食管炎大鼠炎症作用及促BMMSC分化研究
目的:研究MCE在GERD大鼠模型中的抗炎作用以及对体内食管微环境下BMMSC上皮分化的影响。
方法:选用RAW264.7细胞评价MCE的细胞毒性以及对炎性标记物(NO、PGE2、IL-ip)的影响。选择第一部分中对药物干预敏感性最优的AP灌注造模方案，评价MCE在大鼠体内的抗炎作用以及MCE和BMMSC联合使用对GERD的修复效果。SD大鼠分为8组:正常对照组、RE对照组、雷贝拉哩组、单独MCE组(三个剂量亚组)、单独BMMSC组、MCE联合BMMSC组。评估胃体积和胃液的pH、分析粘膜损伤指数，ELISA检测血清中的炎性标记物TNF-α,IL-1β，IL-6和MCP-1,用qRT-PCR检测TNF-a,IL-邛，IL-6和PAI-1的mRNA表达量。选择第一部分中能够引起柱状上皮分化的EGJ手术造模方案评价MCE在体内食管环境下对BMMSC分化方向的影响。手术后移植GFP标记的BMMSC,免疫组化检测体内BMMSC的分化。通过激光共聚焦显微镜检测鳞状上皮标记物Pan-CK和柱状上皮化生标记物CDX2,评价MCE对BMMSC柱状上皮分化和正常鳞状上皮分化的影响。
结果:随着MCE浓度增高，食管炎症呈剂量依赖性降低。在MCE组，ELISA检测到血清炎症标记物的降低，qRT-PCR检测到炎性标记物mRNA的降低。GFP对BMMSC的示踪结果显示，BMMSC能够修复食管反流中损伤的食管上皮。在MCE干预的情况下BMMSC更多的分化为了鳞状上皮细胞而非柱状上皮细胞。
结论:MCE的抗炎作用可以用于治疗大鼠的RE,MCE与BMMSC移植联合治疗能产生协同效应。MCE能够在食管微环境下促进BMMSC向趋向于正常的鳞状上皮分化，并减少其柱状上皮分化，提升BMMSC移植的安全性，成为可能延缓或者阻止BE的中医药物。
骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSC)移植作为近年新兴的生物学疗法，受到了广泛重视。具有免疫原性小、无药物毒副作用、易于获取和扩增的优点。研究表明，在大鼠食管肌层注射干细胞有助于治疗GERD,然而就RE模型来说，BMMSC是否能自然地循环到食管损伤区域并重建损伤的食管粘膜，依然有待研究。
已有研究证实，干细胞的分化取决于它所存在的微环境。因此我们设想:海巴戟天莘取物(MorindacitrifoliaExtract,MCE)或许能通过其自身抗炎抗氧化等作用改善GERD相关的食管炎症，为干细胞向正确方向分化创造更加有利的微环境，促使其更多地向食管正常上皮细胞分化，而非向柱状上皮分化，从而起到延缓巴雷特食管(Barrett esophagus,BE)甚至延缓食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)的作用。
因此，选择MCE联合BMMSC移植治疗GERD,评价它们对GERD的治疗作用能否出现协同效应，并评价其对BMMSC分化的影响。如能减少柱状上皮分化，则有助于提升干细胞移植的安全性，为MCE联合干细胞移植治疗GERD提供相应的理论依据，最终为其临床应用奠定基础和积累经验。本课题共分为三部分研究内容:
第一部分:胃食管反流病大鼠模型的比较研究
目的:评价多种大鼠GERD模型对于药物干预的敏感性以及肠上皮分化发生率。
方法:比较不同时间间隔下外源性酸化胃蛋白酶(Acidified pepsin,AP)灌注模型、三种手术方式食管胃空肠吻合术(Esophagogastricjejunostomy,EGJ)、食管空肠吻合术(Esophageal jejunostomy,EJ)、食管空肠吻合术合并胃切除术(Esophageal jejunostomy and Gastrectomy,EJ/TG)o构建模型成功后的宏观评分，包括充血，水肿，糜烂，溃疡，壁内或腔内出血;HE染色后进行微观评分，包括上皮丢失(分离、糜烂、溃疡)、反应性上皮变化(基底增生、乳头状瘤、有丝分裂、原位角化、角化不全)、血管改变(包括充血、水肿、出血、血管病变)、炎症(炎性细胞聚集和弥散);采用pH电极测定食管下段pH值;超声测定粘膜下血流;采用免疫组织化学方法用抗Ki-67研究粘膜基底细胞增殖;免疫组织化学研究尾侧型同源转录因子2(Caudal-related homeobox transcription factor2,CDX2)、三叶因子1(Trefoil factorl,TFF1).三叶因子2(Trefoil factor％TFF2)的表达。在多种模型中评价宏微观评分在确定性疗效药物治疗后的改善值，评价各种模型对药物干预的敏感性。评价各种造模方法中对柱状上皮化生和不典型增生的影响。
结果:AP灌注构建的模型中，采用45min/bid.持续5d的方案构建的模型包含炎症、糜烂和溃疡等改变，但维持了上皮和一定程度的上皮反应性改变。所有AP灌注构建的模型都没有观察到的柱状上皮化生。AP灌注模型中60min/bid.持续3d和45min/bid.持续5d的造模方案对于药物干预的敏感性要高于手术构建的GERD模型。在手术造模方式中，EGJ术式与其他术式相比，柱状上皮化生率最高，达到39.4％。
结论:外源性AP灌注方案和手术造模方案均可以用于评价药物的有效性。外源性AP灌注45min/bid.持续5d的方案构建的模型对药物干预的敏感性最高，适用于评价MCE联合BMMSC的治疗效果。内源性EGJ手术方式造模促成柱状上皮化生的比例最高，适合研究MCE对BMMSC在食管微环境下分化的影响。
第二部分:MCE促进BMMSC向食管上皮分化的作用及机制
目的:研究BMMSC能否在与食管上皮细胞(Esophageal epithelial cell,EEC)共培养条件向食管上皮分化，并且研究这种分化是否与Wnt/p-catenin信号通路有关，进一步研究MCE对这种分化作用的影响及其作用机制。
方法:将大鼠BMMSC和EEC共培养，使用无直接接触的transwell培养系统将BMMSC与EEC共同培养，并检测EEC的表面标记Pan-CK在BMMSC中的表达。与EEC共培养后，采用Western Blot检测BMMSC中Wnt/p-catenin信号通路的主要成员GSK-3。和p-catenin含量。在BMMSC培养系统中加入Wnt/0-catenin信号激活剂氯化锂，Western Blot检测其对磷酸化的GSK-3R和伊catenin的影响，免疫细胞化学染色检查其对Pan-CK表达量的影响。制备出MCE,高效液相色谱分析鉴定其有效成分。将MCE用于三种情况:与EEC共培养的BMMSC、诱导角化培养基中的BMMSC、普通培养基独立培养的BMMSC,研究MCE对促进BMMSC向上皮分化的作用以及机制。商用试剂盒检测MCE细胞毒性，ELISA检测共培养系统中EGF,细胞化学染色检查上皮分化标记物Pan-CK,qRT-PCR检测MCE对上述三种情况中CK18、CK19、EMA、Wnt3a、p-catenin、EGF、CDX2等基因表达的影响。Western Blot检测MCE对Wnt/p-catenin信号通路相关的Akt和GSK3p的磷酸化水平。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测P-catenin的核内移和转录活性的影响。并且分别加入Wnt抑制剂Dkk-1或PI3K抑制剂LY294002,对比上述检测标的。
结果:与EEC共培养的BMMSC能获得EEC的表型，其内Wnt/0-catenin信号通路的主要成员磷酸化GSK-30和0-catenin增加，通路激活剂氯化锂可增加磷酸化GSK-3β和β-catenin的表达，并增强Pan-CK的表达。说明Wnt/β-catenin信号通路的激活促进了BMMSC上皮分化。MCE有效成分被鉴定为山奈酚-3-O-芸香昔和芦丁两个化合物。MCE未显示出细胞毒性，0.0038％(w/v％)浓度即可提高共培养系统中EGF含量，增强上皮分化标记物Pan-CK细胞中表达，上调CK18、CK19、EMA、Wnt3a、β-catenin、EGF对应基因的表达水平，但对肠源性的CDX2基因无影响。在Wnt/β-catenmfs号通路中，MCE会增加Akt和GSK3β的磷酸化水平以及P-catenin的核转运和转录活性，这些作用会因加入Wnt抑制剂Dkk-1或PI3K抑制剂LY294002而减弱。
结论:与EEC共同培养可以通过激活Wnt/p-catenin通路促进BMMSC的上皮样分化。最小有效剂量为0.0038％(w/v％)的MCE可以通过促进EGF分泌，以及Wnt/p-catenin信号通路的PI3K/Akt依赖性激活增强BMMSC的上皮分化。MCE联合BMMSC移植可能成为修复GERD食管损伤的新型治疗方案。
第三部分:MCE改善食管炎大鼠炎症作用及促BMMSC分化研究
目的:研究MCE在GERD大鼠模型中的抗炎作用以及对体内食管微环境下BMMSC上皮分化的影响。
方法:选用RAW264.7细胞评价MCE的细胞毒性以及对炎性标记物(NO、PGE2、IL-ip)的影响。选择第一部分中对药物干预敏感性最优的AP灌注造模方案，评价MCE在大鼠体内的抗炎作用以及MCE和BMMSC联合使用对GERD的修复效果。SD大鼠分为8组:正常对照组、RE对照组、雷贝拉哩组、单独MCE组(三个剂量亚组)、单独BMMSC组、MCE联合BMMSC组。评估胃体积和胃液的pH、分析粘膜损伤指数，ELISA检测血清中的炎性标记物TNF-α,IL-1β，IL-6和MCP-1,用qRT-PCR检测TNF-a,IL-邛，IL-6和PAI-1的mRNA表达量。选择第一部分中能够引起柱状上皮分化的EGJ手术造模方案评价MCE在体内食管环境下对BMMSC分化方向的影响。手术后移植GFP标记的BMMSC,免疫组化检测体内BMMSC的分化。通过激光共聚焦显微镜检测鳞状上皮标记物Pan-CK和柱状上皮化生标记物CDX2,评价MCE对BMMSC柱状上皮分化和正常鳞状上皮分化的影响。
结果:随着MCE浓度增高，食管炎症呈剂量依赖性降低。在MCE组，ELISA检测到血清炎症标记物的降低，qRT-PCR检测到炎性标记物mRNA的降低。GFP对BMMSC的示踪结果显示，BMMSC能够修复食管反流中损伤的食管上皮。在MCE干预的情况下BMMSC更多的分化为了鳞状上皮细胞而非柱状上皮细胞。
结论:MCE的抗炎作用可以用于治疗大鼠的RE,MCE与BMMSC移植联合治疗能产生协同效应。MCE能够在食管微环境下促进BMMSC向趋向于正常的鳞状上皮分化，并减少其柱状上皮分化，提升BMMSC移植的安全性，成为可能延缓或者阻止BE的中医药物。