近年来,以纳米工程为基础的肿瘤靶向药物递送系统发展迅速,传统观点认为纳米微粒能延长在血液循环中停留时间、逃避网状内皮系统摄取,同时由于实体肿瘤较正常组织所具有的血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差、淋巴回流缺失等病理结构特点,纳米微粒可通过实体肿瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect,EPR效应),从血液循环外渗至肿瘤组织,理论上,纳米颗粒与配体或抗体联合可以选择性输送化疗药物到达肿瘤靶点,然而靶向纳米粒子静脉注射后在肿瘤组织中的生物分布受到很多因素的影响,如给药的纳米粒子、药物、药物测定方法、和其他实验因素等,实际上肿瘤部位药物的实际累积量通常小于5%,超过90%的注射药物在血液循环中即被清除而并没有聚集在肿瘤内。即使纳米颗粒随血液循环到达肿瘤部位,由于肿瘤内部较周围组织增高的组织间隙压力(interstitial fluid pressure,IFP)和更为致密的细胞外基质结构(extracellular matrix,ECM),想要实现肿瘤内的高效靶向递送,纳米颗粒必须克服肿瘤微环境的屏障。研究证明,在培养细胞悬浮液中加入超声造影剂微泡,在超声波的辐照下,细胞膜可对大分子暂时开放,随后闭合,大分子可以进入细胞并被细胞俘获,这种现象称为声孔效应[1-3],利用声孔效应可以增加基因转然效率,导致培养细胞表型改变。声孔效应是声空化所伴随发生冲击波、射流对细胞共同作用的结果。体内实验也证明,超声波触发的微泡破裂,可在超声波辐照的局部使微泡经过的微血管通透性发生短时间一过性增加,标记红细胞、胶体微粒、质粒DNA等可以被投递到超声波辐照的局部组织中,利用超声波靶向微泡破坏((Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)可明显增强大分子物质在体内的高效靶向投递。与正常组织不同,肿瘤新生血管不仅数量增多,而且结构上出现明显异常,包括血管扭曲、扩张、囊泡化、微血管异常吻合及微血管三维空间分布异常,支持内皮细胞的周细胞数量减少,基底膜变薄、不连续,血管壁的通透性增加。理论上这些异常改变有利于微粒通过肿瘤血管壁进入肿瘤细胞间隙。传统UTMD多采用常规超声仪,声场范围大,经体表辐照使声场内所有微泡爆破,并未达到真正意义上的精确定位,声脉冲辐射成像(acousticradiationforceimpulse,arfi)较多的应用于组织弹性成像,但arfi作为一种低强度聚焦脉冲,它较utmd具有的聚焦特性,更小的辐照范围使之能够精确定位微泡爆破的范围。同时研究表明,声辐射力本身作为一种声驱动力,在声波传播方向上能主动促使微泡由血管腔内向血管壁移动,这对于纳米粒子的靶向递送有着重要的作用。本研究通过制备一种fe3o4纳米粒子,基于实体瘤组织的epr特征的肿瘤治疗策略,实现纳米粒子在血液循环中较高的递送,同时利用超声波联合微泡造影剂产生的空化效应,达到物理方法开放肿瘤生物学屏障,增加药物的渗透性达到物理靶向的作用。这种纳米粒子结合新型影像技术的物理靶向递送为肿瘤的靶向治疗提供了新的策略和实验思路。方法及路线1.制备fe3o4纳米粒子并对其一般性质检测:将所需材料按照一定比例配比,采用高温水热法制备fe3o4纳米粒子,调整各部分材料比例,得到不同大小尺寸的fe3o4纳米粒子,选择符合实验需求的fe3o4纳米粒子,用透射电镜对其进行粒径大小及形态学观察,采用马尔文激光粒径仪对其粒径分布、表面电位进行检测。2.对制备的fe3o4纳米粒子进行体外磁共振显影将制备好的fe3o4纳米粒子分散成不同fe浓度的双蒸水混悬液,并将其重悬于含琼脂糖凝胶的离心管中,将上述离心管置于管架上采用7.0tmri扫描,观察fe3o4纳米粒子体外磁共振显影效果。3.建立sd大鼠皮下移植瘤模型将walker256细胞常规培养于1640完全培养液,在细胞增殖处于对数生长期时调整细胞浓度为1×107个/ml备用。大鼠局部用碘伏消毒,将制备的高浓度细胞悬液0.5ml注射于大鼠左后腿皮下,观察大鼠局部皮肤肿胀呈皮丘状,接种后第7天观察,并用于进一步实验。4.arfi破坏微泡增强fe3o4纳米粒子在大鼠皮下移植瘤靶向递送的实验研究sd大鼠随机分成6组:(1)单纯arfi辐照组(2)单纯mbs组(3)arfi辐照mbs组(4)单纯fe3o4纳米粒子组(5)arfi辐照fe3o4纳米粒子组(6)arfi辐照mbs和fe3o4纳米粒子组。处理条件:arfi辐照条件:低频脉冲聚焦超声探头辐照肿瘤部位,间隔5s,累计辐照5min;mbs:经大鼠尾静脉推注经生理盐水稀释后的微泡0.2ml;fe3o4纳米粒子:经大鼠尾静脉推注剂量为5mg/kg Fe3O4纳米粒子。不同处理组给予相应处理,将处理后的SD大鼠肿瘤部位行MRI扫描观察肿瘤组织信号变化;处死SD大鼠,取组织标本行病理学分析。结果及结论1.制备的Fe3O4纳米粒子形态规则,粒径分布均匀,具有磁共振显像功能。2.SD大鼠肿瘤组织普鲁士蓝染色结果为单纯ARFI辐照组、单纯MBs组、ARFI辐照MBs组均未见蓝染颗粒,单纯Fe3O4纳米粒子组、ARFI辐照Fe3O4纳米粒子组、ARFI辐照MBs和Fe3O4纳米粒子组均可见点状蓝染颗粒。其中ARFI辐照MBs和Fe3O4纳米粒子组蓝染颗粒计数明显多于其余两组(P<0.05),其中ARFI+MBs+Fe3O4组纳米粒子蓝染颗粒最多,蓝染颗粒多分布在血管周围。3.SD大鼠肿瘤部位磁共振成像结果为处理前肿瘤在T2*序列上呈现不均匀高信号,部分内部可见点状低信号,考虑为肿瘤局部的坏死灶,单纯ARFI辐照组、单纯MBs组、ARFI辐照MBs组处理前后均未见明显信号改变,单纯Fe3O4纳米粒子组、ARFI辐照Fe3O4纳米粒子组、ARFI辐照MBs和Fe3O4纳米粒子组经相应处理后T2*WI均可见肿瘤内部低信号部分增加。ARFI辐照MBs能够有效地提高Fe3O4纳米粒子在SD大鼠皮下移植瘤组织的分布,增强Fe3O4纳米粒子在活体肿瘤内的靶向递送效果。