聚合物和金属有机骨架化合物作为分离介质选择性富集生物体液中的糖蛋白和糖肽

来源 :北京化工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:leegimars
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顺式二醇类化合物是一类包括核苷、糖蛋白、糖类和核苷酸的生物分子,在各种生物过程中起着重要作用。由于这些物种在复杂的生物样品中丰度较低,导致鉴定和分析比较困难。因此,这类生物分子的特异性和靶向性的捕获对生物学研究和应用都具有重要意义。然而,虽然目前已发展了很多抗体,但它们由于成本高、贮存不稳定等原因,其应用受到限制。为了选择性和特异性的捕捉这类目标生物化合物,发展了不同类型的亲和色谱。其中,亲水作用色谱(HILIC)和硼酸亲和色谱(boronate affinity chromatography)以其独特的特性被广泛应用于选择性捕获和释放目标顺式二醇类化合物。在本研究中,基于这两种亲和色谱模式,合成了用于选择性富集顺式二醇小分子、糖肽和糖蛋白的分离富集材料。本文的主要内容如下:(1)制备了一种硼酸功能化GMA-MAA-DVB聚合物材料,并用于选择性提取核苷、糖肽和糖蛋白并应用于蛋白组学。这种新型聚合物在蛋白质组学中首次报道,它具有高的BET比表面积(为132.8447m2g-1)保证其具有高富集能力,平均孔径(为20.3449 nm)提供纳米限制效应,有助于与目标物实现强相互作用。甲基丙烯酸和二乙烯三胺的亲水性,以及硼酸对糖基化生物分子的固有亲和力,使得对肽的选择性富集高达1:500,同时对糖蛋白的选择性高达1:1000。顺式二醇化合物的结合常数在10-4-10-6 M范围内,理论结合容量对辣根过氧化物酶为85 mg g-1,对免疫球蛋白G为180 mgg-1。此外,硼酸功能化聚合物(BFP)对糖蛋白和糖肽的富集,在信噪比(S/N)≥3时其浓度范围在1 pg mL-1-0.04 ng mL-1之间。最后,利用该材料从健康人唾液样品中富集糖蛋白,鉴定出6种糖蛋白。(2)硼酸类亲和材料在选择性富集糖蛋白时存在结合pH值高易使蛋白变形等问题,因此,3,5-二羧基苯硼酸被用作选择性捕获和释放糖蛋白的新型亲和配体。因为3,5-二羧基苯硼酸的pKa值为7.8,刚好接近生理pH值,非常适合糖蛋白的快速结合和洗脱,可以避免其在富集过程中降解和失活。使用支链聚乙烯亚胺(PEI)将3,5-二羧基苯硼酸连接到聚合物载体表面,由于PEI具有大量的胺基可用于连接3,5-二羧基苯硼酸,从而利用协同作用增强了其结合强度。将所得亲和材料装在移液枪头中,使用亲水性三聚氰胺泡沫作为筛板,以使分离过程平滑、简单、可靠且耐用。在优化的萃取条件下,这种基于硼酸亲和性的尖端萃取技术对模型糖蛋白的结合常数在10-6-10-7 M范围内,结合容量在0.66μM g-1到2 μM g-1范围内,对辣根过氧化物酶(HRP)和牛血清白蛋白(BSA)的选择性高达1:1000。最后,将硼酸亲和性的尖端萃取技术成功地应用于选择性捕获母乳中的糖蛋白,特别是乳铁蛋白,其在乳品生产中具有重要的意义。(3)内源性糖肽在多种病理生理系统中具有重要意义,由于生物体液中干扰物种的存在和其存在的丰度低等原因,严重阻碍了直接检测其含量。由于MOF材料具有完美的阵列方式,三维结构和可调控的孔隙率等特点,其被认为在该领域极具潜力和理想的材料。因此,我们用水热法合成了配体含胺基钛金属有机骨架化合物NH2-MIL-125(Ti),并对其进行了表征。然后,将NH2-MIL-125(Ti)晶体填充在移液器尖端上,为使萃取过程平稳、简单且可靠,以亲水性三聚氰胺泡沫为支撑筛网。由于结构中含有胺基基团,使得材料具有较好的亲水性和独特的孔隙率,有助于排除大尺寸蛋白质,最大可达1:700。所制备的亲和Tips对糖蛋白的检测限为1 fmol μL-1,选择性高达1:1000(HRP和BSA酶解后)。此外,对该材料进行重复性评价,材料使用5次后,扫描电镜图像显示MOF晶体没有结构变化,富集倍数没有变化。最后,利用MOF填充的移液枪头,选择性地从健康唾液中捕获N-连接内源性糖肽,并鉴定出64种独特的内源性糖肽。这些结果表明,NH2-MIL-125(Ti)基亲和尖端对糖肽具有很好的应用前景,可用于富集生物体液中的微量糖肽生物标记物。(4)基于微尖端的固相微萃取被认为是一种绿色、高效的分析样品制备技术,但其萃取过程易受到限制,如吸附床不稳定、尖端易堵塞等,尤其处理低渗透性的生物样品。这些问题可以通过在微尖端萃取材料中引入一种具有良好机械强度和特定功能性的柔性基底来解决,以捕获所需的生物分子。本文采用水热法将UiO-66-NH2晶体接枝到PDA包覆的三聚氰胺弹性泡沫(MF)海绵表面,既保持了良好的机械加工性能,又获得了表面MOF晶体。考虑到三聚氰胺泡沫具有良好的有序性和柔性结构,将其用作萃取材料并用于亲水性相互作用色谱(HILIC)。金属有机骨架由于其优异的性能,将其修饰到聚多巴胺表面上。通过将材料压入针尖的锥形结构中,对所得材料进行表征。该亲和尖端萃取材料具有良好的可调通透性,可用于选择性富集糖肽和磷酸肽。将其对辣根过氧化物酶和β-酪蛋白的胰蛋白酶消化液中的糖肽和磷酸肽进行富集,得到了良好的性能,检测下限高达0.5 fmolμL-1,并且在5次富集循环过程中保持稳定。此外,这种亲和性尖端萃取对糖肽的选择性高达1:1000(HRP和BSA酶解液),对磷酸肽的选择性高达1:200(β-酪蛋白和BSA酶解液)。同时其也表现出其他一些吸引人的特性,如:对大尺寸蛋白质有极好的尺寸排除效应、适度的背压、重现性、可重复使用等,并成功应用于人类唾液样品。综上,这些策略能够从复杂的生物样品中选择性识别和分离顺式二醇类生物分子化合物,可以进一步在药物和生物医学分析领域进行拓展。在未来,拥有更加稳定的填充吸附剂和适度背压的亲和尖端萃取技术通过与自动机械系统结合,从而实现对核苷、聚糖、糖肽或糖蛋白的快速定量分析。
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