丙型肝炎病毒（HCV）是一种RNA病毒,易变异,感染后隐匿性强,不易觉察,并且具有传染性,是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病爆发的主要原因。每年HCV新增感染病例超过300万,目前全世界存在1.7-1.8亿的感染者,约占全球人口总数3%。由于在研发HCV疫苗过程中缺乏可用的动物模型,经由临床验证的可用疫苗迟迟未得以研发。HCV中NS3/4A丝氨酸蛋白酶是一种异二聚体结构的金属蛋白酶,主要负责HCV NS3-NS5B非结构蛋白的水解和成熟,对于HCV增殖和复制过程具有重要作用。一旦该蛋白酶的活性被抑制,HCV即失去增值复制的能力,因此,NS3/4A丝氨酸蛋白酶一度成为抗HCV药物研发的重要靶点。简单、灵敏的HCV蛋白酶活性检测方法对于其抑制剂的筛选和相关药物的研发具有重要意义。目前基于HCV蛋白酶活性的传统检测方法,如:荧光共振能量转移法,化学发光法,电化学检测法等,大多具有耗时长、需要大型仪器和专业操作人员的协助等缺陷,因此迫切需要开发快速、便捷的HCV NS3/4A蛋白酶活性检测的新方法。侧流层析试纸条具有简单便携,检测时间短等独特优势,但由于其可视化过程依赖于显色剂的聚集,并且缺少优异的信号放大机制,导致灵敏度较低。我们课题组前期发展了一种蛋白酶靶向的可激活RNA聚合酶转录机制,用于信号的转换和放大。本文工作将该种信号放大机制与侧流层析试纸条相结合,从而实现HCV蛋白酶的便捷、可视化检测。主要开展以下工作:1、响应NS3/4A蛋白酶活性的可激活RNA聚合酶(PRN S 3/4 A)的克隆、表达及基本性质探究。根据课题组此前开展的系列工作,我们基于分子克隆技术构建重组质粒p ET28a-prN S 3/4 A,并表达重组蛋白PRN S 3/4 A。该蛋白由T7溶菌酶和T7 RNA聚合酶经连接多肽串联而成,其中连接多肽含有NS3/4A蛋白酶可特异性识别的多肽序列。我们同时通过异源表达获得了NS3/4A蛋白酶,将激活型T7 RNA聚合酶的转录产物设计为G-四链体。当NS3/4A蛋白酶存在时,T7 TNA聚合酶被激活,转录产物可以与小分子Th T相结合,在495 nm处发出荧光,验证了PRN S 3/4 A的蛋白酶响应性和信号转换放大功能。为后续基于试纸条的NS3/4A蛋白酶可视化检测奠定了基础。2、构建可响应HCV NS3/4A蛋白酶活性的侧流层析试纸条。我们将具有酶切激活信号转换放大能力的PRN S 3/4 A与侧流层析试纸条相结合,发展了快速、便捷检测NS3/4A活性的试纸条。通过Au与-SH的相互作用,我们将寡核苷酸链1修饰于纳米金,试纸条检测线TL和对照线CL处通过划线技术固定有捕获寡核酸链2和捕获寡核苷酸链3,寡核苷酸链1和寡核苷酸链3互补。PRN S 3/4 A的转录产物被设计为可分别与寡核苷酸链1及寡核苷酸链2互补的核酸序列。当NS3/4A蛋白酶存在时,T7 RNA聚合酶被激活,转录出RNA,其可在TL处与核酸功能化的纳米金形成“三明治”结构,随着捕获的纳米金增多,TL处显示肉眼可见的红色,从而实现便捷直观地检测NS3/4A蛋白酶活性。随后我们对蛋白浓度进行优化,并进行选择性、灵敏度实验,结果表明基于侧流层析试纸条的新方法可以实现对HCV NS3/4A蛋白酶活性的灵敏可视化检测,检测限低至5 p M。3、基于分子内相互作用提升T7 RNA聚合酶转录效率的探究。T7 RNA聚合酶需先识别溶液中模板的启动子序列,才能启动后续的RNA合成。该转录生成RNA的过程一般是在异相体系中进行。为了缩短T7 RNA聚合酶搜寻启动子的时间,提升其转录效率,我们尝试将T7 RNA聚合酶与核酸共价偶联标签DCV蛋白融合表达。该融合蛋白T7 RNAP-DCV通过DCV的作用,与转录模板共价结合形成转录复合物,以期将T7 RNA聚合酶与转录模板之间的分子间相互作用转换为分子内相互作用。初步实验结果显示,该设计可使T7 RNA聚合酶转录效率提升6倍,具有可行性。