核黄素是重要的精细化工产品，在医药、食品和饲料工业领域有广泛的应用。目前，核黄素工业生产方法主要是采用重组枯草芽孢杆菌发酵法。在解除了枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的反馈抑制后，核黄素操纵子的表达水平是影响核黄素合成速率和最终产量的关键因素。可以采用构建游离型和整合型的重组质粒，实现核黄素操纵子的过量表达，但是，游离质粒固有的不稳定性，以及整合质粒需要使用抗生素不断选择所带来的环境安全问题，使这种技术方法存在缺陷。CcpA蛋白是枯草芽孢杆菌的一种全局调控蛋白，介导细胞的碳分解代谢物阻遏。CcpA蛋白的缺失可以在一定程度上解除碳分解代谢物阻遏效应，而有利于核黄素的合成。从功能上判断，ccpA基因应该是组成型表达，其启动子应属于中强启动子。利用ccpA基因的表达元件表达核黄素操纵子的结构基因，既可以实现核黄素操纵子的过量表达，又可以缺陷CcpA蛋白，解除碳分解代谢物阻遏对核黄素合成的抑制，是一种构建高产核黄素基因工程菌的简便、多效的方法。 本文以产核黄素的重组菌B.subtilis24为出发菌株，首先采用同源重组方法对其recA基因的缺陷进行了恢复，得到B.subtilis24 X1。摇瓶培养结果显示，B.subtilis24 X1的生长速率和最大生物量均高于B.subtilis24，核黄素合成能力提高了25％。 对ccpA基因表达元件进行的序列分析和比对显示，其启动子具有中强启动子的特征，SD序列和终止子序列都与共同序列十分接近，属于强表达元件。 采用重叠PCR方法，将ccpA基因的启动子及上游片段、ribDEAH结构基因、ccpA的终止子及下游片段进行拼接，构建出了4.4kb的C1-R-C2片段。然后转化白色的核黄素缺陷株B.subtilis24CS1，筛选得到了黄色转化子。经PCR扩增和凝胶电泳鉴定显示，ccpA的结构基因被ribDEAH结构基因置换。所得转化子为B.subtilis24X2。从菌落黄色结果判断，在B.subtilis24X2中，ribDEAH结构基因被ccpA基因的表达元件正确表达。