Nrf2信号通路在铅致SH-SY5Y细胞毒性和凋亡中保护作用的研究

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铅是广泛存在于环境中的有毒重金属,铅暴露所致的神经细胞凋亡是神经毒性的重要表现之一。核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-realated factor2,Nrf2)信号通路是机体对抗外源性氧化应激和毒效应的非常重要的防御体系之一,但在铅神经毒性中的作用和机制还研究甚少。因此,本实验拟用不同剂量的醋酸铅对SH-SY5Y细胞进行染毒,以观察Nrf2转录活性的变化,并探讨Nrf2是否对铅所致SH-SY5Y细胞的毒性和凋亡发挥保护作用及相关的机制。本研究主要由以下二部分组成第一部分醋酸铅对SH-SY5Y细胞Nrf2转录活性的影响目的:探讨醋酸铅对核转录因子Nrf2转录活性的影响。方法:用不同剂量的醋酸铅溶液(5μmol/L、25μmol/L、125μmol/L)对体外培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞染毒,用凝胶迁移试验(EMSA)测染毒后6h、12h、24h细胞核内Nrf2-ARE结合能力;用MTT测染毒后12h、24h细胞活力。结果:与对照组相比,醋酸铅染毒染毒使Nrf2-ARE的结合能力明显升高(P <0.05),并呈现时间剂量依赖效应;不同浓度醋酸铅处理细胞后,细胞存活率降低(P <0.05),增殖受到不同程度的抑制,并呈现剂量反应关系。结果提示,醋酸铅激活了SH-SY5Y细胞Nrf2的转录活性,随染毒剂量的升高胞核内Nrf2-ARE结合能力增强。结论:醋酸铅可激活SH-SY5Y细胞Nrf2的转录活性。第二部分Nrf2在铅致SH-SY5Y细胞毒性和凋亡中保护作用的研究目的:研究Nrf2对铅致SH-SY5Y细胞毒性和凋亡中的保护作用,并从分子水平上探讨Nrf2对铅致SH-SY5Y细胞凋亡保护作用的机理。方法:用0μmol/L,0.2μmol/L,1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L姜黄素干预细胞24h后,提取核蛋白,用凝胶迁移试验(EMSA)测细胞核内Nrf2-ARE结合能力;用前述试验确定好的姜黄素浓度预处理细胞24h后,再对细胞进行醋酸铅染毒,用MTT检测细胞活力,用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡,用western法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:SH-SY5Y细胞经醋酸铅(125μmol/L)处理24h后,MTT实验表明,与单纯铅染毒组相比较,姜黄素预处理+醋酸铅染毒组细胞存活率都明显升高(P <0.05);流式细胞术和TUNEL结果显示,醋酸铅导致神经细胞的凋亡增加(P <0.05),姜黄素预处理+醋酸铅染毒组细胞凋亡率明显降低(P <0.05);western结果显示,铅染毒使胞浆中Caspase-3、Bax、Cytochrome C的表达升高,Bcl-2的表达降低;姜黄素预处理+醋酸铅染毒组的Caspase-3、Bax、Cytochrome C的表达低于单纯醋酸铅染毒组(P <0.05)。结论:Nrf2对铅致神经细胞的毒性和凋亡有保护作用;Nrf2对凋亡的保护作用可能与其对凋亡相关蛋白的调控有关。
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