论文部分内容阅读
脑缺血是脑部组织血流量不足的一种疾病,这种情况通常可以导致脑组织的代谢率以及能量的降低,和随之引起来的局部区域的脑梗死。当脑缺血这种情况发生时,由于来自于血液的氧以及营养物的供给减少,可能使脑部的神经元组织产生饥饿感。饥饿可以诱导细胞产生凋亡,它有两个转移方向,一是往好的方向转化:即恢复生存,二是往坏的方向转化:即进入死亡。从病理生理学上来讲,再灌注损伤通常发生在缺血期后血液供应重新返回脑组织时。与缺血性损伤相比,局部缺血/再灌注(I/R)可能是引起线粒体呼吸链反应的破坏以及脑部组织脑损伤区域中炎性介质的过量产生以及包浆中的Ca2+离子大量沉积从而对神经元造成的更多的损害;在临床外科上,有包括急性缺血性中风以及急性创伤性脑损伤等很多种脑部疾病,都可以引起缺血以及再灌注损伤。再灌注损伤在临床上被认为是继发性脑损伤的重要因素。线粒体在调节细胞生命活动过程中起着重要的作用,它在细胞中以较高的速度不停的运动着,通过自我分裂或者彼此间相互融合,实现新个体的产生,并可以在细胞中形成一种紧密的联系。线粒体通常被人们称作“细胞动力工厂”,其分裂和融合是否平衡,影响着功能和结构的变化。经过以前的研究表明,线粒体可以减少细胞色素C、以及调亡蛋白AFI因子等的表达,从而在细胞的程序性死亡中起着重要的调控作用。我们通过对大鼠短暂性脑I/R损伤模型的分析表明,线粒体分裂的多少与细胞凋亡的程度有着密切的关联,抑制线粒体的分裂能够减轻脑皮质部分的I/R损伤。另外,有研究证实:线粒体的分裂过程中,钙信号通路可以对线粒体分裂相关蛋白Drpl的磷酸化与去磷酸化产生影响,进而对线粒体的分裂起到调控作用;因此如果减少线粒体摄取钙离子的量,就可以降低线粒体的分裂能力,减少分裂线粒体的分裂次数;在我们以前的实验中也曾发现,降低MCU活性,对脑梗死面积及自由氧产生有一定的抑制作用,减轻线粒体肿胀损伤。这点在大鼠短暂性I/R损伤模型中得到了很好的体现。右美托咪定是一种通过选择性激动发挥其作用的镇静剂以及镇痛剂,主要作用于α2肾上腺素受体。以前的研究已经证明过,右美托咪定可防止缺血再灌注损伤诱导的对心肌,肾,肠,肝,肺以及脑的损伤。同时Kuhmonen等人发现右美托咪定能够对大鼠中脑动脉闭塞引起的脑梗死有很大的益处。右美托咪定还可以减少炎性介质诱导的Ca2+释放以及钙超载减少炎症的继续进展。最新研究表明右美托咪定可以抑制氧糖剥夺或者Ca2+诱导线粒体肿胀而保持线粒体形态与功能的稳定,抑制海马神经元钙超载,减少钙调神经磷酸酶的激活,进而抑制线粒体分裂,其机制可能是通过抑制钙调神经磷酸酶的活性,减少其对Drp1-ser637的磷酸化,进而抑制Drp1的转位,减少与线粒体外膜蛋白Fis1的结合;另外,它还可以抑制Drp1-ser637与Fis1的表达,减少它们在线粒体外膜的共定位结合,从而抑制线粒体分裂的启动。凋亡是I/R诱导的神经元损伤中的主要途径。线粒体在涉及细胞凋亡调节的内在途径中起重要作用。I/R诱发引起来炎症因子可以引起线粒体的结构和功能异常,导致Cyt C从线粒体释放到细胞质中和随后级联激活半胱天冬酶-9,-3和-6,进而引起相关的凋亡级联反应,Caspase-3的激活是线粒体凋亡必须经历的过程,它通过与其他家族成员的级联反应,可以加速细胞的凋亡。因此我们就假设右美托咪定可以通过抑制钙超载来减少线粒体分裂、保持线粒体形态与功能的稳定,进而通过抑制线粒体-细胞色素C-半胱氨酸蛋白酶凋亡途径,来减少神经元细胞的凋亡,从而发挥脑保护作用。目的:探讨右美托咪定在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中的作用,以及右美托咪定对线粒体分裂的的影响。方法:新生24h之内的SD大鼠,断头分离大脑海马区神经组织,收集获得神经元细胞进行原代海马神经元培养,培养至第8天,氧糖剥夺法建立海马神经元缺氧复氧模型,按照随机数字表法将其随机分为6组::空白对照组(C组),细胞未给予任何处理;赋形剂组(V组),赋形剂二甲基亚砜(DMSO),终浓度为0.01%]加入细胞培养基;缺氧复氧组(H/R组);右美托咪定组:D1、D2、D3组,在细胞缺氧复氧期间分别加入右美托咪定0.1、1、10μmol/L。分组处理之后,用细胞增殖与毒性检测试剂盒检测各组细胞活性(确定右美托咪定合适的浓度范围)、用透射电镜观察线粒体的超微结构、用激光共聚焦显微镜观察各组神经元细胞质Ca2+荧光强度、用ELISA法检测细胞钙调神经磷酸酶活性、用Western-blot检测Drp1、Fis1、Cyt C、capase3蛋白的表达。用流式细胞学检测神经元细胞的凋亡率。结果:与对照组比较,H/R组的细胞数目以及活性显著减少,与H/R组比较,右美托咪定组(D1、D2、D3)细胞数量相对增加,并且D2组的细胞活性比D1和D3相对要高。与对照组相比,H/R组的细胞凋亡率显著增多,与H/R组比较,右美托咪定组(D1、D2、D3)细胞凋亡率相对降低,并且D2组的细胞凋亡率比D1和D3相对要低。与对照组相比,神经元Ca2+荧光强度、钙调神经磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3蛋白的表达升高(P<0.05);与H/R组比较,D1、D2、D3组神经元活性增强、线粒体超微结构破坏明减轻,神经元Ca2+荧光强度、钙调神经磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3的表达均降低(P<0.05);D2组又较D1、D3组细胞活性增强,细胞质Ca2+荧光强度、钙调神经磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3的表达均降低(P<0.05)。结论:右美托咪定0.1、1、10μmol/L可以明显改善大鼠海马神经元在缺氧复氧中的损伤,其中1μmol/L是最佳的保护浓度,其机制可能是与右美托咪定抑制钙超载介导的线粒体分裂及线粒体凋亡途径有关系。