双酶法合成D-HPG转化条件的研究及高产菌株的选育

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本论文以中华根瘤菌S菌为对象,考察了菌种生长特性的基础性参数,包括生长曲线、发酵液pH值的变化、菌种形态。结果显示:菌体在14小时左右达到最大生长量;发酵液pH值随着时间的变化而升高;菌体偏小,相连,呈椭圆形。 在前期工作的基础上,进行了双酶法合成D-对羟基苯甘氨酸过程基础参数的考察,首先建立了前体和产物的定性及定量检测方法,即TLC法和HPLC法;后对菌种转化能力进行考察,核实了该菌种确有转化能力,在对菌体内酶活的测定中得出,在菌体对数生长期后期酶活达到最大值。同时对生物转化条件进行了优化,包括前体的溶解度问题、缓冲液pH值、菌体和前体量的比例等,结果显示:缓冲液pH值为7.0,适当提高菌浓和底物浓度的比例都有较高的转化率。 对菌体进行紫外诱变、NTG诱变、紫外加NTG诱变、紫外加氯化锂诱变等多次诱变,以提高菌体的酶活力,采用底物类似物抗性筛选法来初筛高产菌株,HPLC法复筛。测定了上万株有5-氟尿嘧啶抗性的突变株的酶活力,得到的突变株S-8-56转化率比出发菌株提高了2.15倍。 对菌体的液体培养基进行了优化,对碳源、氮源、金属离子、磷酸盐及pH值等因素进行了考察,对此菌的产酶条件的研究表明,产酶的最佳碳源为甘油和蔗糖,最佳氮源为酵母提取物。柠檬酸和Cu2+离子对产酶有明显抑制作用。此菌产酶最适培养基组成为(%):蔗糖0.5,甘油1.0,酵母提取物0.5及NaCl 0.3,MnSO4·4H2O 0.01,CaCl2·2H2O 0.02,MgSO4·7H2O 0.01,FeSO4·7H2O 0.01,K2HPO4·3H2O 0.1。酶的最适培养基的初始pH值为6.5,培养条件为30℃,14h。 经过对转化条件的优化,菌种的诱变筛选及培养基的优化,菌株的转化率达到68.5%,比初始值提高了8.78倍。
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