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甘草是最常用大宗药材,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用,有“十药九甘草”之称。近些年来,由于甘草野生资源遭到了严重破坏,栽培甘草已经成为商品甘草的主流。但是,大部分栽培甘草存在品质退化和甘草酸含量低等问题,达不到《中国药典》规定的合格标准,既影响甘草临床疗效,也制约栽培甘草的出口。因此,提高栽培甘草的质量已经成为制约甘草资源可持续发展的关键问题。甘草酸是甘草中最主要的活性成分,具有抗炎、抗癌、增强免疫力等诸多作用。目前萜类化合物的代谢途径已明确,在此途径中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)、鯊稀合成酶(squalene synthetase,SQS)、β-香树脂醇合成酶(β-amyrinsynthase,β-AS)是3个关键酶,与甘草酸生物合成具有密切关系。基因组拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是指与基因组参考序列相比,基因组中≥1 kb的DNA片段插入、缺失和/或扩增及其互相组合衍生出的复杂变异。目前已发现不少人类复杂性状疾病和CNVs有密切关系。本课题组在对甘草酸功能基因的研究过程中发现甘草功能基因存在拷贝数多态性。根据分子生物学中心法则,基因拷贝数的变化会导致基因表达量及其相应酶量的变化,从而引起其催化产物产量的改变。因此,如果能够增加甘草中这三个关键基因的拷贝数,就有可能增加其对应的酶量,从而促进甘草酸的生物合成。因此,本课题试图从甘草酸代谢途径上HMGR、SQS1、β-AS三个功能基因入手,从天然植物、酵母表达体系以及转基因再生植株3个层面分别分析功能基因CNVs与甘草酸次生代谢之间的相关性,从而完整的阐述甘草功能基因CNVs对于次生代谢网络的调控作用,并最终获得甘草酸高产的甘草株系,为今后应用生物技术大量生产甘草酸及缓解甘草酸药源短缺等问题提供一条新的途径。本课题共取得了如下结果:(1)在甘草整体植株水平证实功能基因CNVs影响次生代谢产物甘草酸的含量。6种功能基因拷贝数组合类型中,B类型(β-AS+HMGR+SQS=1+2+1)、A类型(β-AS+HMGR+SQS=1+1+1)更有利于甘草酸的积累,而C类型(ê-AS+HMGR+SQS=2+1+1)似乎不利于甘草酸的积累。B类型及A类型全部来自于甘草的道地产区,而C类型中有2/3来自于甘草的非道地产区。说明功能基因CNVs组合类型、甘草酸含量以及产地之间具有很好的对应关系。(2)在考察功能基因CNVs与甘草外部形态及显微构造的相关性时发现:功能基因CNVs与株高、地茎、茎皮颜色、一级侧枝数、茎刺毛数等外部形态指标以及栅栏组织厚度、海绵组织厚度、主脉维管束直径等显微指标之间无明确的相关性。但就叶片表面腺点数而言,无论是哪一种CNVs类型,其叶片背面的腺点数均要多于正面的腺点数,且B类型是整体腺点数较多的类型。同时,由于B类型也是甘草酸含量较高的类型。因此推测腺点数与甘草酸含量之间具有一定的相关性。(3)在毕赤酵母工程菌水平证实甘草功能基因CNVs明确影响次生代谢产物水平。实验中发现无论是过表达甘草SQS1基因的酵母工程菌,还是过表达甘草HMGR基因的酵母工程菌,其次生代谢终产物麦角甾醇的含量均高于空白对照。此外,在两大类过表达不同外源基因的酵母工程菌中均出现类似的现象,即:随着外源基因拷贝数的增加,酵母菌中麦角甾醇的含量呈现先上升后下降再上升的趋势。(4)建立了利用药用植物功能基因拷贝数研究药用植物有效成分变化规律的新技术体系。即:首先测定该药用植物有效成分代谢途径上关键功能基因的拷贝数,其次测定该植物中次生代谢产物的含量,最后分析二者间的相关性。(5)成功的构建了甘草3个功能基因的根特异性表达载体及相应的工程菌,并获得了根特异性过表达3个功能基因以及组成型过表达3个功能基因的甘草再生植株。这对于进一步揭示甘草酸合成代谢的分子机制奠定了物质基础。