研究目的恶性肿瘤严重危害人类健康,其死亡人数约占世界总死亡人数的四分之一,且死亡率常年居高不下。目前用于恶性肿瘤治疗的手段主要包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和射频消融治疗等,由于缺乏特异性和靶向性,在杀伤肿瘤细胞的同时,机体正常细胞的功能也遭到破坏,从而导致患者免疫功能受损,生存质量下降。近来,随着免疫学、分子生物学和细胞生物学的交融和发展,以机体免疫细胞为主体的细胞免疫治疗,以其强大的抗肿瘤作用和较低的毒副作用,逐步成为肿瘤治疗研究的新方向。自然杀伤(Natural killer,NK)细胞作为机体天然免疫系统中不可或缺的组成部分,是机体抵抗肿瘤和病毒感染细胞的第一道天然防线,也是连接天然免疫和获得性免疫之间的桥梁。基于NK细胞的抗肿瘤免疫治疗以其独特的抗肿瘤效果引起人们的高度重视,现己进入临床试验阶段,主要包括白体NK细胞的活化,同种异体NK细胞的输注,体外扩增NK细胞的输注以及NK细胞系的过继转输等。由于体外NK细胞的纯化和大规模培养仍具有较高的技术难度,NK细胞系以其易于体外扩增和大规模培养、具有较强的细胞毒作用等优点,克服了自体以及同种异体NK细胞治疗的局限性,具有广阔的应用前景。NK细胞系在体外生长状态良好,能够通过基因修饰等手段增强抗肿瘤活性。在众多活化NK细胞的细胞因子中,IFN-α占有非常重要的地位。IFN-α属于I型干扰素家族,广泛应用于造血系统肿瘤和某些实体肿瘤的治疗中,并且能够通过下调癌基因的表达,诱导肿瘤抑制基因进而影响肿瘤细胞的功能,还能够促进免疫细胞,比如T细胞,DC,NK细胞的分化和活化,介导IFN诱导的抗肿瘤免疫活性。IFN-α现已被广泛应用于DC的基因修饰,使其适应肿瘤过继免疫治疗的要求白细胞介素-15(IL-15)是由Grabstein等于1994年在猴肾表皮细胞系cv21/EBVA的培养上清中发现,早期被定义为T细胞生长因子,在自体内环境的稳定,调节天然免疫和获得性免疫方面发挥多重作用。IL-15与IL-2在功能上有许多相似之处,均可以诱导CD34+的细胞分化为NK细胞,但IL-15在NK细胞的分化和功能上发挥了更为重要的作用,实验证实,在IL-15Rα-1-和IL-15-/-小鼠中,NK细胞无法正常发育、成熟并发挥功能。本研究选用了两种对NK细胞发育、分化、功能等起关键作用的细胞因子IL-15和IFN-α,对NK细胞系NKL进行基因修饰。建立了hIFN-a基因修饰的NKL细胞,证实修饰后的细胞能够有效抑制肝癌的生长,并探讨了作用机制。前期实验中建立了hIL-15基因修饰的NKL细胞系,并证实了其在体外对肝癌细胞的杀伤效果,本研究进一步确证了hIL-15修饰后NKL细胞在体内对肝癌的治疗效果,并初步探讨了其作用机制。同时研究了hIL-15基因修饰后的NKL细胞对白血病的抑制效果和作用机制。结果证实,修饰后的NKL细胞具有更为显著地抗肿瘤作用,更加符合肿瘤过继免疫治疗的要求。研究方法首先,我们建立了hIFN-a基因修饰的NKL细胞,并研究其对肝癌的抑制作用和杀伤机制。通过PT-PCR方法从外周血PBMC中扩增hIFN-α1基因全长,插入pSecTagB真核表达载体中；通过电穿孔技术将hIFN-a基因转染入NKL细胞中；通过RT-PCR方法检测hIFN-a基因转染后,NKL细胞IFN-a的mRNA水平,和肝癌细胞上凋亡相关分子Fas、Mcl-1、Bcl-xl的表达水平；通过RNAi技术,下调HepG2细胞上Fas的表达水平；通过Real-time PCR检测NK细胞杀伤相关分子的mRNA水平；通过流式细胞术,检测NK细胞杀伤相关分子和HepG2细胞Fas的蛋白水平；通过MTT法检测NK细胞对肝癌细胞系以及原代肝癌细胞的杀伤；通过抗体阻断实验,检测IFN-γ和TNF-α在NKL-IFNa细胞对HepG2细胞杀伤过程中的作用；利用皮下注射和腹腔注射两种不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型,通过检测荷瘤小鼠瘤体积和小鼠生存期来验证NKL-IFNα细胞的治疗效果。其次,我们验证了hIL-15基因修饰的NKL细胞对肝癌的治疗作用,并探讨其作用机制。利用皮下注射和腹腔注射两种不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型,通过检测荷瘤小鼠脾重、肝重、瘤重、脾脏淋巴细胞数和小鼠生存期来验证NKL-IL15细胞的治疗效果；通过ELISA检测NK细胞上清中IFN-y和TNF-a的分泌水平；通过流式细胞术检测NK细胞杀伤相关分子NKp80、颗粒酶B、Perforin、TRAIL和HepG2细胞上NKG2D配体的表达水平；通过细胞计数法检测与NKL-IL15细胞共培养后,HepG2细胞的增殖能力；通过MTT法检测NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性；通过抗体阻断实验,检测NKG2D、IFN-y和TNF-a在NKL-IL15细胞对HepG2细胞杀伤过程中的作用。最后,我们探讨了hIL-15基因修饰的NKL细胞对白血病的治疗作用。通过MTT法检测NK细胞对白血病细胞系以及原代白血病细胞的杀伤活性；通过ELISA检测NK细胞上清中IFN-y和TNF-a的分泌水平；通过流式细胞术检测NK细胞杀伤相关分子NKp80、颗粒酶B、Perforin和K562细胞上NKG2D配体的表达水平；通过通过细胞计数法检测与NKL-IL15细胞共培养后,K562细胞的增殖能力；通过抗体阻断实验,检测NKG2D、IFN-y和TNF-a在NKL-IL15细胞对K562细胞杀伤过程中的作用；利用皮下注射和腹腔注射两种不同荷瘤方式建立NOD/SCID鼠荷瘤模型,通过检测荷瘤小鼠瘤体积、瘤重和小鼠生存期来验证NKL-IL15细胞的治疗效果。结果结果一：hIFN-a基因修饰NKL细胞系的建立及其抗肝癌功能与机制研究1.构建hIFN-a基因修饰的NKL细胞系我们已经成功建立了hIFN-a基因修饰的NKL细胞系,NKL-IFNa细胞能够分泌大量的IFN-α。2IFN-a基因修饰能够增强NKL细胞对HCC的杀伤活性NKL-IFNa细胞对肝癌细胞系HepG2、H7402细胞和原代肝癌细胞的杀伤活性显著增强。特别是,IFN-α基因修饰亦能增强NKL细胞对HBV+肝癌肿瘤细胞HepG2.2.15细胞的杀伤效果。3.IFN-α基因修饰增强NKL细胞的活性hIFN-α基因修饰能够上调NKL细胞中杀伤相关分子TNF-α、IFN-γ、perforin、Granzyme B和FasL的表达,从而增强NKL细胞对HCC的细胞毒性。4.NKL-IFNa细胞诱导的Fas表达能够增强对HCC的杀伤敏感性HCC表面Fas的表达在NKL-IFNa细胞介导的细胞毒性反应中起到主导作用。阻断HepG2细胞表面Fas的表达,会使NKL-IFNa细胞所介导的杀伤效果显著下降。5NKL-IFNa细胞通过分泌TNF-a和IFN-y诱导HCC细胞上Fas的表达阻断TNF-α和IFN-γ能够降低HepG2表面Fas的表达,进而抑制了NK细胞介导的细胞毒性作用。说明,NKL-IFNa细胞对HCC的杀伤是Fas依赖的,TNF-α和IFN-γ介导的。6.IFN-α基因修饰能够增强NKL细胞在小鼠体内抑制肝癌的效果NKL-IFNα细胞能够在腹腔荷瘤和皮下荷瘤小鼠模型中,抑制小鼠体内肝癌细胞的生长,延长小鼠的生存期。结果二：hIL-15基因修饰的NKL细胞系在小鼠体内抗HCC作用及机制研究1.在小鼠荷瘤模型中,IL-15基因修饰的NKL细胞具有显著抗HCC作用NKL-IL15细胞治疗能够有效抑制腹腔和皮下荷瘤两种荷瘤小鼠模型中肝癌细胞在荷瘤小鼠体内的生长,延长小鼠的生存期,发挥良好的治疗效果。2.IL-15基因修饰能够增强NKL细胞对HCC细胞的应答IL-15基因修饰后的NKL细胞,对HepG2细胞的刺激更加敏感,能够上调杀伤相关分子的表达,从而增强对HCC的杀伤效果。3.IL-15基因修饰的NKL细胞能够抑制HCC细胞的增殖IL-15基因修饰的NKL细胞能够通过分泌细胞因子,抑制HCC的增殖,增强抗肿瘤功效。4.IL-15基因修饰的NKL细胞通过分泌TNF-α和IFN-γ上调HCC细胞上NKG2D配体的表达NKL-IL15细胞通过分泌TNF-a和IFN-y上调HCC细胞上NKG2D配体的表达,进而增强HCC对NK细胞的杀伤敏感性。5.NKL-IL15细胞杀伤功能的增强依赖于NKG2D的识别和TNF-α的分泌NKG2D的识别和TNF-α的分泌,在NKL-IL15介导的HCC杀伤过程中起到非常重要的作用。结果三：hIL-15基因修饰NKL细胞的抗白血病功能及机制研究1.hIL-15基因修饰能够增强NKL细胞对白血病细胞的杀伤功能hIL-15基因修饰能够增强NKL细胞对白血病细胞系和原代白血病细胞的杀伤功能。2.IL-15基因修饰的NKL细胞能够抑制白血病细胞的增殖,诱导白血病细胞上NKG2D配体的表达IL-15基因修饰的NKL细胞能够通过分泌细胞因子抑制白血病细胞的增殖,同时诱导白血病细胞表面NKG2D配体的表达,促进了NKL细胞对白血病细胞的杀伤。3.IL-15基因修饰促进了NKL细胞的活化IL-15基因修饰能够增强NKL细胞杀伤相关受体和分子的表达,进而增强NKL细胞对白血病细胞的杀伤功能。4.IL-15基因修饰NKL细胞杀伤功能的增强依赖于NKG2D和IFN-y NKG2D的识别和IFN-y的分泌,在NKL-IL15介导的白血病细胞杀伤过程中起到非常重要的作用。5.IL-15基因修饰能够增强NKL细胞在小鼠体内的抗肿瘤效果NKL-IL15细胞能够抑制小鼠体内白血病细胞的生长,延长小鼠的生存期。6.NKL-IL15细胞能够活化hPBMC,增强其对白血病细胞的杀伤NKL-IL15细胞具有对hPBMC的活化作用。结论1.构建hIFN-α基因修饰NKL细胞,在体内和体外实验中均证实其对肝癌的抑制作用,且NKL-IFNa细胞通过分泌TNF-α和IFN-y诱导HCC细胞上Fas的表达,依赖Fas/FasL途径发挥细胞毒作用。2.验证前期构建的hIL-15基因修饰的NKL细胞,在小鼠体内对肝癌的抑制作用,其杀伤作用依赖于NKG2D的识别和’TNF-α的分泌。3.探讨hIL-15基因修饰的NKL细胞对白血病的治疗作用,初步研究其杀伤机制是依赖于NKG2D和IFN-γ。基因修饰的NK细胞系,可以通过细胞因子IL-15和IFN-α的修饰,增强细胞毒作用,使其适用于肿瘤的过继免疫治疗。基因修饰NK细胞系的应用,能够为疾病治疗带来新的思路。