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研究背景英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)表明2型糖尿病(T2DM)的治疗效果随着时间的延长越来越差,糖化血红蛋白(HbA1c)水平越来越高,导致糖尿病并发症难以控制,患者最终难以避免致死和致残的威胁。其中一个重要原因是患者的胰岛β细胞功能随着时间的延长逐渐下降。在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物出现之前,T2DM的药物治疗不能改善β细胞功能,仅为对症治疗。虽然研究提示GLP-1类似物可改善β细胞功能,但是需要长期注射应用存在不方便,且具有抑制胃肠道蠕动等不良反应。新的保护和恢复胰岛功能的手段一直是医学界期待和研究的方向。近年来,干细胞以其促进再生等一系列功能成为研究的热点。动物实验把干细胞应用到糖尿病大鼠中得到了令人欣慰的结果,干细胞可以恢复糖尿病大鼠的胰岛功能,纠正高血糖,其机制可能与促进自体胰腺干细胞再分化有关。因此人们热切的期待干细胞治疗糖尿病特别是T2DM这一具有庞大人群疾病的临床结果。本试验通过自体骨髓干细胞及高压氧(HOT)联合治疗,观察治疗糖尿病胰岛功能改善及血糖控制好转情况,从临床角度研究干细胞对T2DM胰岛损伤的恢复能力,改善血糖控制的效果及可能的不良反应。目的探索从采集的人骨髓中分离、培养间充质干细胞(MSC)的方法,建立人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)的体外培养体系,为后续的干细胞研究提供稳定的细胞模型。将体外培养的BM-MSC和体外分离的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BM-MNC)同时移植入糖尿病患者体内,研究骨髓干细胞联合HOT治疗T2DM的有效性与安全性方法(l)采用经典的贴壁培养法培养BM-MSC,在含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基中进行培养,获得人BM-MSC。吖啶橙-碘丙啶(AO-PI)染色鉴定其活性。通过流式细胞仪分析其表面标记(CD29,CD73,CD90,CD105,CD34,CD45)以及成骨、成脂肪等多向诱导分化等鉴定MSC特征。通过染色体分析MSC P5代遗传学改变。接种于裸鼠背部皮下,术后3天及1、3个月肉眼观察成瘤情况。取三代到五代(P3-P5)的BM-MSC用于后续实验。临床应用前进行细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测等检查。(2)T2DM患者80例,男48例,女性32例,进入研究前均接受胰岛素治疗,随机分为骨髓干细胞(BM-SC)联合HOT治疗组(BM-SC+HOT组),骨髓干细胞治疗组(BM-SC组),HOT治疗组和常规治疗组(对照组)。BM-SC+HOT组和BM-SC组接受首次自体骨髓采集以培养自体BM-MSC,BM-MSC制备成功后拟进行输注,输注当日接受二次骨髓采集以分离BM-MNC。BM-SC+HOT组接受BM-MSC及BM-MNC胰腺动脉内输注治疗和输注前后共20次HOT治疗,BM-SC组接受BM-MSC及BM-MNC治疗,HOT组接受20次HOT治疗,以上3组均在胰岛素治疗基础上接受干预,对照组只接受胰岛素治疗。胰腺动脉采用术前CT血管造影(CTA)及术中数字减影血管造影(DSA)分析。4组患者随访1年,每3个月随访1次,观察患者体重、血压、体重指数(BMI)、腹围及胰岛素用量变化,评估血糖控制情况、生活质量评分,复查HbA1c、空腹血糖、空腹C肽及其它实验室指标。实验获得医院伦理委员会批准。所有患者均签署临床试验知情同意书。结果(1)经贴壁培养48h后可见散在细胞,形态呈成纤维样,72h后通过全量换液去除各种残留血细胞,MSC呈分散存在或几个形成细胞团,7-10天后,贴壁细胞数量明显增多,分布及生长均匀,排列整齐,呈梭形或长多边形,形态不均一。原代培养10-14天细胞可达80-90%融合,0.25%胰蛋白酶常规消化,按1:2的比例传代,传代后的BM-MSC形态与原代基本相似,经过3代后BM-MSC基本达到形态均一。AO-PI染色鉴定活性>95%。流式细胞术细胞表型的鉴定分析显示BM-MSC CD29、CD73、CD90、CD105高表达(99.65±0.44%,98.5±0.84%,98.7±0.78%,98.8±0.37%),而CD34、CD45低表达(0.77%±0.17%,1.86±0.21%)。MSC培养至第5代,未发现染色体核型异常改变。实验裸鼠在观察期内均未见结节形成或可疑病灶产生。诱导分化实验表明BM-MSC在体外具有向骨、脂肪细胞分化的能力。临床应用前细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测等均为阴性。(2)BM-SC+HOT组和BM-SC组在随访结束时与治疗前相比HbA1c(%)降低(7.02±0.78 vs. 7.99±0.70, p<0.01; 6.98±0.80 vs. 8.48±0.69, p<0.01),胰岛素用量(IU)降低(25.25±12.57 vs. 35.05±13.34, p<0.01; 26.95±13.77 vs. 37.10±13.23 , p<0.01),空腹血糖(mmol·L-1)降低(6.47±1.17 vs. 7.78±2.20 , p<0.05; 7.25±1.72 vs. 8.13±2.13 , p<0.05),空腹C肽(ng·mL-1)升高(1.96±0.78 vs. 0.99±0.70, p<0.01; 1.81±0.80 vs. 1.02±0.69, p<0.01),生活质量评分升高(86.3±16.2 vs. 67.4±19.6, p<0.01, 83.3±16.0 vs. 62.8±14.2, p<0.01)。BM-SC+HOT组和BM-SC组在随访结束时与对照组相比较HbA1c降低(7.02±0.78 vs. 8.11±0.55, p<0.01; 6.98±0.80 vs. 8.11±0.55, p<0.01),胰岛素用量降低(25.25±12.57 vs. 38.60±8.20, p<0.01; 26.95±13.77 vs. 38.60±8.20, p<0.01),空腹血糖降低(6.47±1.17 vs. 8.37±2.35, p<0.01; 7.25±1.72 vs. 8.37±2.35, p<0.05),空腹C肽升高(1.96±0.78 vs. 1.11±0.53, p<0.01; 1.81±0.80 vs. 1.11±0.53, p<0.01),生活质量评分升高(86.3±16.2 vs. 68.2±18.1, p<0.01, 83.3±16.0 vs. 68.2±18.1, p<0.01)。HOT与对照组在随访结束时与治疗前相比HbA1c、胰岛素用量、空腹血糖、空腹C肽及生活质量评分差异无统计学意义。HOT组在随访结束时与对照组相比HbA1c、胰岛素用量、空腹血糖、空腹C肽及生活质量评分差异无统计学意义。干细胞治疗相关不良事件包括一过性发热(n=2),一过性腹痛(n=5),穿刺性出血(n=3)等。CTA及DSA发现胰体尾部优势动脉主要为胰背动脉(50%),其次为胰大动脉(15.7%)和胰横动脉(10.8%)。胰背动脉和胰大动脉共同作为优势动脉占21.6%。结论(l)利用贴壁培养法分离培养,可获得足量的人BM-MSC。培养的BM-MSC活性高,表型均一,并具有多向分化潜能,无致瘤性,临床安全性高,可用于进一步的组织工程、细胞和分子生物学研究。(2)骨髓干细胞胰腺动脉内输注治疗可以恢复T2DM患者部分胰岛功能,减少胰岛素用量,从而显著改善血糖控制,提高患者生活质量。干细胞治疗副作用较小,与HOT联合治疗未能进一步提高治疗效果。HOT单独治疗T2DM对病情无改善效果。(3)胰体尾优势供血动脉变异大,来源复杂,分析其变异状况有利于提高干细胞治疗的成功率。