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【研究背景】肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是肾脏组织在手术等因素影响下发生一段时间内缺血后又恢复供血时所诱发的肾组织损伤过程。肾缺血再灌注损伤是导致围手术期急性肾损伤的重要原因之一,同时也是肾移植过程中必然出现的病理学事件,是影响肾移植手术成功率的主要不利因素之一。肾缺血再灌注损伤的发生机制较为复杂,其具体诱因及分子病理机制尚不完全清楚。已知组织恢复供血后,过量的活性氧自由基攻击微血管与组织细胞,是造成组织缺血再灌注损伤的直接原因。同时,组织缺血会引发肾小管细胞、内皮细胞等发生凋亡坏死;而血液再灌注后则会引起肾管近端小管细胞以及树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等白细胞加速分泌趋化因子与细胞因子,促进炎症反应发生,加剧肾组织损伤。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor1,SDF-1)是趋化因子CXC家族成员之一,又名CXCL12,是炎症反应的重要参与者。SDF-1可与CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor-4,CXCR4)结合,形成SDF-1/CXCR4轴,是机体内调控骨髓细胞归巢及各类干细胞迁移分化的重要作用物质,参与机体中枢神经系统、免疫系统等正常发育的调控过程。此外,SDF-1/CXCR4轴在多种病理条件下的作用也已有许多报道,可参与肿瘤的发生与生长、肿瘤血管生成、炎症反应的发生、缺氧缺血性脑损伤、心肌缺血再灌注损伤、骨再生修复、肝脏干细胞移植等重要的病理事件。而其在肾缺血再灌注损伤过程中是否存在作用尚不明确。综上可知,SDF-1/CXCR4轴作为一种重要的骨髓间质干细胞转运以及炎症反应发生的调节者,在组织损伤修复等病理学过程中扮演着重要角色。那么,SDF-1/CXCR4在肾组织缺血再灌注损伤发生时是否存在异常表达?在肾缺血再灌注损伤过程中是否也发挥调控作用?其分子机理是否与肾微血管内皮细胞等的功能活性的变化有关?上述问题的解答对于进一步阐明肾缺血再灌注损伤发生的分子病理机制具有重要意义。基于此,我们构建了低温缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞(renal microvascular endothelial cell,RMVEC)模型与大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型,拟通过体内外实验分析SDF-1/CXCR4在缺血再灌注损伤肾脏组织中的表达情况及功能机制。【研究目的】以体外培养的肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型及大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型为对象,在体内外条件下,分析缺血再灌注损伤发生后SDF-1与CXCR4分子的表达情况,研究SDF-1/CXCR4表达变化对缺血再灌注引发的大鼠肾组织损伤有何影响,以及SDF-1/CXCR4轴是否对缺氧复氧损伤的肾微血管内皮细胞的凋亡及免疫活性存在作用。以此为基础,探讨SDF-1/CXCR4的表达变化与缺血再灌注肾组织损伤之间的关系与作用机制,为深入理解肾缺血再灌注损伤病理机制及寻找防治措施提供依据。【研究方法】1.构建肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型及大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型原代分离培养肾微血管内皮细胞,以低温缺氧复氧条件处理构建肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型。通过无损伤血管夹经腹阻断左右双侧肾动脉的方法构建肾缺血再灌注损伤动物模型;检测模型大鼠肾组织中血清尿素氮、血清肌酐值以及大鼠尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)浓度,以苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色法观察大鼠肾组织病理学变化、进行肾小管坏死评分。2.检测SDF-1与CXCR4分子在损伤动物模型及细胞模型中的表达情况以大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型与肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型为对象,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)法及酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测模型手术后不同时间点大鼠肾组织及模型细胞中SDF-1与CXCR4分子的信使核糖核酸(messenger RNA,m RNA)与蛋白水平。3.分析SDF-1表达变化与模型大鼠肾小管坏死评分间相互关系以大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型为对象,计算模型大鼠肾小管坏死评分;分析SDF-1表达变化与模型大鼠肾小管坏死评分间相关性。4.分析SDF-1/CXCR4对缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞凋亡活性的影响以缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞模型为对象,以不同浓度重组SDF-1(0、25、50、100μg/L)或CXCR4抑制剂AMD3100(0、5、10、20μM)处理模型细胞24 h,通过Western Blot法检测模型细胞凋亡分子Caspase-3的表达水平,流式分析法检测细胞凋亡水平。5.分析SDF-1/CXCR4对缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞免疫活性的影响以SDF-1或CXCR4抑制剂AMD3100处理模型细胞,将模型细胞与外周血分离获得的淋巴细胞混合培养,检测不同处理后混合培养淋巴细胞的增殖活性,同时以ELISA法检测血管内皮细胞(endothelial cell,EC)活化因子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)与免疫活性因子白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的表达水平。6.分析SDF-1/CXCR4对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用以大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型为对象,重组SDF-1或CXCR4抑制剂AMD3100尾静脉注射处理,分析不同处理后模型大鼠肾组织的损伤程度。【研究结果】1.构建了肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型及大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型原代分离培养肾微血管内皮细胞,以低温缺氧复氧条件处理构建了肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型。通过无损伤血管夹经腹阻断左右双侧肾动脉的方法构建了肾缺血再灌注损伤动物模型。模型大鼠肾组织中血清尿素氮、血清肌酐值以及大鼠尿NGAL浓度均显著增高,大鼠肾损伤加剧,并出现明显的病理学变化。2.证实了SDF-1与CXCR4分子在损伤动物模型及细胞模型中均存在异常表达利用大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型与肾微血管内皮细胞缺氧复氧损伤细胞模型为对象,发现SDF-1与CXCR4分子在模型大鼠肾脏组织及缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞内的表达水平均显著增高,且其表达量随着模型手术后时间的延长,呈现逐步上升趋势。3.发现SDF-1表达的变化与模型大鼠肾小管坏死评分呈正相关性以大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型为对象,发现大鼠术后各时间点的肾小管坏死评分逐渐增高,并且SDF-1表达水平的变化与大鼠肾小管坏死评分变化情况呈正相关性。4.发现SDF-1/CXCR4对缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞的凋亡具有抑制作用在体外条件下,以重组SDF-1或CXCR4抑制剂AMD3100处理缺氧复氧损伤的肾微血管内皮细胞,发现SDF-1对模型细胞凋亡水平的增高具有抑制作用,而CXCR4抑制剂处理则会显著增强模型细胞的凋亡水平。5.发现SDF-1/CXCR4对缺氧复氧损伤肾微血管内皮细胞免疫活性的增高具有抑制作用在体外条件下,以重组SDF-1或CXCR4抑制剂AMD3100处理缺氧复氧损伤的肾微血管内皮细胞,发现SDF-1对模型细胞促淋巴细胞活化的能力具有抑制作用,而CXCR4抑制剂处理则会显著增强模型细胞的免疫活性。6.发现SDF-1/CXCR4对大鼠肾缺血再灌注损伤具有保护作用以大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型为对象,重组SDF-1或CXCR4抑制剂AMD3100处理,发现SDF-1可降低模型大鼠肾组织的损伤程度,而CXCR4抑制剂处理则会加剧肾组织损伤。【结论】本研究发现大鼠肾缺血再灌注发生时,肾组织中SDF-1/CXCR4的表达水平显著增高,高表达的SDF-1/CXCR4可通过抑制缺血再灌注损伤所引发的肾微血管内皮细胞的凋亡及免疫活性的增强,从而对大鼠肾缺血再灌注损伤发挥保护性作用,延缓组织损伤进程。