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背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤,恶性程度高,预后差,行外科手术切除后5年复发率高达65%以上,术后转移复发是影响肝癌预后的最主要因素。因此,深入研究肝细胞癌复发及转移的分子机制,对其的病程进展、预后评估及治疗均有重要意义。MicroRN As (miRNAs)是一类高度保守的长约19～22个核苷酸的非编码小RNA分子,其通常靶向一个或者多个mRNA,互补结合其3’端的非转录区域(3’-UTRs),从而在翻译水平的抑制或直接降解目的mRNA,负向调节靶基因的表达。大量研究发现,]miRNAs调节着涉及细胞生长、增殖、分化以及肿瘤的发生发展转移等重要生物学过程。MicroRN A-126(MiR-126)及其互补序列microRNA-126*(miR-126*)起源于EGFL7第七内含子,并特异性高表达于血管内皮细胞,可促进胚胎时期的血管新生及维持血管的完整性。近年来,许多研究发现,miR-126/miR-126*在非小细胞型肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中的表达下调且扮演着抑癌基因的角色。但是miR-126及miR-126*在肝细胞癌中的作用及具体机制尚未清楚。本研究采用荧光定量PCR检测肝细胞癌组织标本miR-126/miR-126*的表达并分析其与肝细胞癌相关病理参数的关系。采用Agomir-126转染肝癌细胞株MHCC97H及HCCLM3上调miR-126的表达,分别采用CCK8增殖实验、流式细胞术、TUNEL实验及Transwell迁移及侵袭实验检测转染后肝癌细胞株的增殖、凋亡、周期、迁移及侵袭侵袭力的变化。通过Western bloting检测转染后肝癌细胞株的凋亡相关蛋白、EMT相关蛋白及可能靶基因的表达,探究miR-126的表达对肝细胞癌细胞株的生物学特性影响。第一章MiR-126/miR-126*在肝细胞癌中的表达目的研究miR-126/miR-126*在肝细胞癌中的表达及其与临床病理参数的关系。方法1、收集南方医科大学南方医院肝胆外科2010年11月～2013年7月接受手术治疗的74例HCC患者的组织标本,-80℃低温保存,术后均经病理学检查证实。2、采用RealTime-qPCR技术检测74例HCC患者的癌组织以及相对应的非癌组织中的miR-126/miR-126*的表达,并进一步分析癌组织中miR-126/miR-126*表达与临床病理特征的关系。结果1、荧光定量PCR检测74例HCC癌及非癌组织中miR-126/miR-126*的表达,miR-126及miR-126*在肝细胞癌组织的表达显著低于相应的非癌组织。2、复发的病例癌组织中miR-126/miR-126*的表达显著低于未复发的病例。3、有肝硬化的病例miR-126*的表达量显著高于无肝硬化的病例。4、Kaplan-Meier生存分析表明,miR-126/miR-126*低表达的病例术后无瘤生存时间均显著差于低表达的病例。结论在肝细胞癌中,miR-126/miR-126*的表达均显著低下调,且其低表达提示肝细胞癌患者预后不良。第二章过表达miR-126对肝细胞癌生物学特性的影响目的在体外研究miR-126的表达对肝癌细胞株增殖、凋亡、周期、迁移及侵袭的影响及其影响细胞生物学特性的分子机制。方法1、采用荧光定量PCR检测五种不同侵袭转移潜能的肝癌细胞株HepG2. SMCC-7721、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3中miR-126的表达情况,筛选靶细胞以便进行下一步实验。2、采用Agomir-126转染高侵袭潜能的MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株,上调miR-126的表达,通过荧光定量PCR检测转染后miR-126的表达,验证miR-126过表达效果。3、应用CCK-8法检钡MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞转染后细胞增殖情况,并通过流式细胞技术检测细胞凋亡、细胞周期,应用TUNEL实验检测细胞凋亡情况；通过迁移实验和侵袭实验检测MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞转染agomir-126后细胞迁移和侵袭能力的变化。4、应用Western bloting检测转染后三种肝癌细胞株细胞凋亡相关蛋白(caspase-3、capase-8、Bax、P53)、EMT相关蛋白(Snail、Slug、MMP2、MMP9、 β-catenin、Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin)及可能靶基因(IGFBP2、VEGF-A、 MerTK, ADAM9)的表达。结果1、Agomir-126转染入MHCC97H及HCCLM3细胞后,miR-126显著升高。2、Agomir-126过表达miR-126后,肝癌细胞株MHCC97H及HCCLM3的增殖较对照组及空白组显著下降。3、Agomir-126过表达miR-126后,肝癌细胞株MHCC97H及HCCLM3凋亡比例较对照组及空白组显著升高。4、Agomir-126过表达miR-126后,促进细胞凋亡的蛋白Caspase-3、 Caspase-8、Bax表达升高,P53无明显变化。5、Agomir-126过表达miR-126后,肝癌细胞株MHCC97H及HCCLM3的细胞周期均无明显变化。6、Agomir-126过表达miR-126后,肝癌细胞株MHCC97H及HCCLM3发生迁移及侵袭细胞数较对照组及空白组显著降低。7、Western bloting检测miR-126过表达后MHCC97H及HCCLM3中EMT相关蛋白的表达发现：上皮细胞表型标志物E-cadherin表达明显升高,间质细胞表型标志物N-cadherin显著下调；促EMT蛋白Snail、Slug、Vimentin、MMP2及MMP9表达显著降低,β-catenin无明显变化。8、在MHCC97H及HCCLM3细胞系中过表达miR-126后,IGFBP2、MerTK无明显变化,VEGF-A显著上调,ADAM9显著下调。结论在肝癌细胞株中,miR-126表达上调可抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭,诱导其凋亡,并靶向作用于ADAM9,抑制EMT进程从而间接地影响其转移潜能。