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目的: 探讨乙肝病毒X蛋白能否激活MLK3-MKK7-JNK信号模块,从而活化Fas/FasL死亡受体信号通路诱导HepG2细胞的凋亡。
方法: 采用分子生物学的方法构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,通过双酶切鉴定后,选出阳性克隆进行DNA测序。脂质体转染法将HBx的表达载体pcDNA3.1-X转染入HepG2细胞建立HBX的高表达模型(pcDNA3.1-X组),将pSilencer3.1-shHBX与pcDNA3.1-X按3:1共转染入HepG2细胞建立干扰HBX表达的细胞模型(RNAi组),同时设立只转染pcDNA3.1空载质粒的HepG2细胞对照(HepG2组)和以通用阴性对照质粒代替pSilencer3.1-shHBX的阴性对照(阴性对照组)。转染72小时后,分别以RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光技术检测HBX的表达量。流式细胞仪、Tunel染色和Hochest33258染色检测细胞的凋亡情况。同时采用Western blot和免疫细胞化学检测MLK3-MKK7-JNK信号模块及Fas-L, Bax,p-Bcl-2蛋白的表达情况,分光光度法检测caspase3,caspase8的活性。
结果:
1、重组干扰质粒即表达载体pSilencer3.1-shHBX测序鉴定结果与质粒的设计序列一致。
2、与HepG2细胞组相比,在pcDNA3.1-X 转染组和阴性对照组中,Western blot检测显示MLK3、MKK7、JNKs磷酸化水平明显增加(P<0.05),Fas-L蛋白相对表达量亦增加(P<0.05);而在RNAi模型中上述蛋白指标均降低,与pcDNA3.1-X 转染组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
3、分光光度法检测结果显示,与HepG2细胞组相比,在pcDNA3.1-X 转染组和阴性对照组中, caspase8 , caspase3 酶活性增强( P<0.05 );而在RNAi 模型中,caspase8,caspase3酶活性减弱,且与pcDNA3.1-X 转染组和阴性对照相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
4、经流式细胞术等方法检测结果显示HepG2细胞凋亡率在pcDNA3.1-X 转染组中较HepG2细胞组显著增加(P<0.05);而在RNAi模型中,细胞凋亡率下降,且与pcDNA3.1-X 转染组和阴性对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1、成功构建了靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX;
2、HBx蛋白可以作为应激原激活MLK3-MKK7-JNK信号模块而活化死亡受体通路诱导HepG2细胞的凋亡。