猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,1992年被世界动物卫生组织（Office international des epizooties,OIE）列为A类传染病,给养猪业造成极大损失。目前,我国防控CSF的主要措施是接种猪瘟兔化弱毒苗,猪瘟兔化弱毒疫苗存在毒力反强的风险,且无法从血清学上区分感染和免疫动物（Differentiating infected from vaccinted animals,DIVA）,十分不利于CSF的净化。因此,研制新型猪瘟标记疫苗显得尤为重要。本研究将多个特异性抗原表位基因与除去跨膜区的CSFV E2基因串联组成重组基因CSFV E2B,将重组基因CSFV E2B克隆至携带绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）标记的和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒表达载体p EB-cop GFP（T2A）puro中,构建重组质粒p EB-CSFV E2B-6His-cop GFP（T2A）puro,通过PCR、双酶切及序列测定等方法对其进行鉴定。将成功构建的重组质粒p EB-CSFV E2B-6His-cop GFP（T2A）puro与辅助质粒PLP1、PLP2和PLPV共转染至HEK-293T细胞中进行慢病毒包装,于转染后48 h,通过荧光显微镜观察细胞中绿色荧光激发情况。结果显示,90%以上细胞中可观察到绿色荧光,表明重组慢病毒HIV-1-p EB-E2B包装成功。将重组慢病毒HIV-1-p EB-E2B感染CHO-K1细胞,对感染细胞进行传代培养,通过激光共聚焦技术检测发绿色荧光的CHO-K1细胞里融合蛋白CSFV E2B的表达情况。结果显示,在细胞核中检测到GFP的表达,在细胞核与细胞质中均检测到融合蛋白CSFV E2B的表达,表明已成功将重组基因CSFV E2B整合至CHO-K1细胞基因组中。以CSFV E2单克隆抗体为一抗,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）对表达的融合蛋白反应原性进行检测。结果显示,所有细胞中均可观察到特异性荧光,表明融合蛋白具有良好的反应原性。上述结果表明,成功获得表达融合蛋白CSFV E2B的重组细胞CHO-K1-CSFV E2B。为进一步获得稳定高效表达融合蛋白CSFV E2B的重组单克隆细胞株,本研究运用有限稀释法结合嘌呤霉素加压筛选,对重组细胞CHO-K1-CSFV E2B进行荧光强度实时观察,获得4株细胞状态好、荧光强度高的CHO-K1-CSFV E2B重组单克隆细胞。进一步通过蛋白免疫印迹（Western blot,WB）半定量方法检测上述4株重组单克隆细胞的融合蛋白表达水平,筛选出融合蛋白表达水平最高的细胞株,其培养物中融合蛋白浓度可达68μg/m L。通过q RT-PCR技术对上述4株重组单克隆细胞中融合蛋白基因m RNA的转录水平进行检测。结果与半定量检测结果相符。结果表明,本研究成功构建出1株高效表达融合蛋白CSFV E2B的重组单克隆细胞CHO-K1-CSFV E2B（+）。将该重组单克隆细胞株进行传代培养,采取q RT-PCR方法检测第5代、10代、15代和20代细胞中融合蛋白基因m RNA的转录水平。结果显示,各代次细胞中融合蛋白基因m RNA的转录水平基本一致。表明重组基因CSFV E2B能在单克隆细胞株CHO-K1-CSFV E2B（+）中稳定表达。综上所述,本研究筛选出1株稳定高效表达融合蛋白CSFV E2B的重组单克隆细胞CHO-K1-CSFV E2B（+）,且该细胞表达的融合蛋白具有良好的反应原性。本研究以期为猪瘟新型亚单位疫苗的研究提供参考。