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目的:食管癌是人类常见的恶性肿瘤。中国男、女平均死亡率分别为7.7/10万和18.8/10万,严重危害着人们的健康。流行病学资料显示膳食缺乏维生素、亚硝酸盐含量增高以及食物霉菌污染等可能与食管癌发生有关。随着分子生物学的发展,发现食管癌的发生发展涉及到多个基因的改变,是癌基因的激活与抑癌基因失活长期协同作用的结果。因此深入研究食管癌的发病机制,以有效地对其进行预防和治疗有着非常重要的意义。MT是一类广泛分布于生物体体内的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质,在维持金属离子内稳态、重金属的解毒、清除自由基等方面具有重要作用。至今已发现MT的四种同分异构体,即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。相对于其他金属硫蛋白,MT-3具有特异结构和特异生物学功能,是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白质。为了研究金属硫蛋白-3与食管癌的关系。将MT-3基因克隆至真核表达载体EX-T3737-M03中,以空载体及携带MT-1基因的EX-H2598-M56表达载体作对照,质粒分别转染Eca109,TE13两株食管癌细胞中,使MT-3高表达,研究MT-3对食管癌细胞行为的影响,从而确定MT-3在食管癌中发挥的作用。方法:1选取食管鳞癌细胞系Eca-109和TE13,用RPMI1640培养基在六孔板中进行培养至细胞生长达80%后,准备进行转染。2分别取含有EX-T3737-M03,EX-T3737-M03-MT3及EX- H2598-M56- MT1三种质粒的大肠杆菌菌株,摇菌,过夜培养,提取高纯度的质粒,-70℃保存,待行转染。3分别配制EX-T3737-M03,EX-T3737-M03-MT3及EX- H2598-M56- MT1三种质粒DNA/脂质体复合物,将以上质粒DNA/脂质体复合物与两种细胞株在六孔板内共同培养4~6小时,分别在24h、48h、72h在倒置荧光显微镜下观察真核表达质粒中荧光蛋白在细胞内表达情况,并计算细胞转染效率,以确定该三种真核表达质粒在细胞内最佳转染时间。4同法将以上三种质粒与两种细胞株分别在九十六孔板内行瞬时转染,设六复孔,各复孔重复上述操作,每组重复三次,然后选择490nm的波长,分别在0,24,48,72h应用MTT法在酶联检测仪上测定吸收光度OD值,并记录结果。并以所得结果以时间为横轴,OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。5将各种载体转染Eca-109和TE13细胞48h后,分别收集六孔板中各组细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡率。6计量资料用平均数±标准差表示,组间比较用单因素方差分析进行,所有数据均由SPSS13.0软件包完成。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1三种质粒DNA转染食管鳞癌Eca-109及TE13细胞后,在24h、48h、72h荧光显微镜观察到各转染组均见有荧光标记,MT-3及其空载体呈绿色荧光,MT-1呈红色荧光,转染24h后细胞荧光表达强度最强,约占细胞总数的70-80%,提示转染成功,且效率较高。2显微镜下分别观察转染外源基因的Eca109,TE13两株食管癌细胞,发现转染EX-T3737-M03-MT3的Eca109,TE13两株细胞在培养48小时后开始变圆,呈现不同程度的萎缩,部分细胞脱落死亡;而转染EX-T3737-M03,EX-H2598-M56-MT1的Eca109,TE13两株细胞未发现明显异常,基本与正常细胞生长状态基本相同。3转染后0小时三组的OD值为0.282±0.015,转染后24小时空载体组,MT3组及MT1组的OD值分别为0.580±0.023,0.577±0.035,0.475±0.025 (p<0.05, MT3组vs空载体组及MT1组)。转染后48小时空载体组,MT3组及MT1组的OD值分别为0.868±0.035,0.877±0.035,0.489±0.030(p<0.05,MT3组vs空载体组及MT1组)。转染后72小时空载体组,MT3组及MT1组的OD值分别为1.079±0.110,1.075±0.113,0.410±0.027(p<0.05,MT3组vs空载体组及MT1组)。从细胞生长曲线图上可以看见MT3组在24小时、48小时分别受到抑制,而在72小时受到最大抑制。而空载体组及MT1组在各个时段抑制不明显。4正常食管癌细胞组凋亡率为(5.10±0.65)%,转染48小时空载体组凋亡率为(5.26±0.73)%,转染48小时MT1组凋亡率为(4.98±0.78)%,转染48小时MT3组凋亡率为(14.10±0.80)%。(p<0.05,MT3组vs空载体及MT1组)。结论:1国内首次采用瞬时转染技术研究MT3基因对食管癌细胞增值的影响。2 MT1基因对食管癌细胞的生长无抑制作用,MT3基因对食管癌细胞的生长有明显抑制作用。3 MT3有促进食管癌细胞凋亡的作用。4 MT-3对食管癌细胞的生长抑制及促凋亡作用,提示MT -3基因在食管细胞内可能为细胞凋亡基因。5转染MT -3基因,诱导其高表达,有望成为治疗食管癌的新方法。