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第一部分局部进展期中低位直肠癌辐射抗拒相关MicroRNA的筛选
目的：构建中低位局部进展期直肠癌人源性肿瘤动物模型(patient-derived xenograft, PDX)并对荷瘤裸鼠和5个直肠癌细胞株的放疗反应能力进行检测，筛选出与辐射抗拒呈正相关miRNA和辐射抗拒的直肠癌细胞株。
方法：
1.于术中自河北医科大学第四医院外二科获得中低位局部进展期直肠癌患者的新鲜手术肿瘤组织标本，将标本锐性分离为两等份：其中一份冻存于-150℃冰箱内，另一份接种于荷兰裸鼠肩部/臀部构建PDX模型。
2.采用单次16Gy的辐射剂量照射PDX模型的肿瘤部位，于辐射后10天测量移植瘤的体积并处死荷瘤鼠、剥离瘤组织进行HE染色，评价移植瘤对辐射反应情况。
3.根据移植瘤对辐射反应的评价结果，筛选出接受辐射后肿瘤组织学达到病理完全反应(pathologic complete response, pCR)的标本和无/低反应(no/low response, N/L R)的标本各3例，将与其对应的冻存于-150℃冰箱内的标本进行miRNA芯片检测，筛选出差异表达foldchange值＞2.0的miRNA，并采用qRT?PCR检测方法对筛选出的差异miRNA在直肠癌组织中进行验证。
4.传代培养直肠腺癌HRC?99、HR?8348、SW1463、SW837、RCM?1细胞系，将这5种细胞按照一定数量分别种植于培养皿，待细胞贴壁后分别进行单次剂量为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的放射线照射，进行辐射干扰下的克隆形成实验，继而筛选出对辐射抗拒的细胞株。
5.根据miRNA芯片的筛选结果和组织验证的结果，采用qRT?PCR技术，对可能导致直肠癌辐射抗拒性增高的miRNA在上述5个直肠癌细胞系中的表达量进行检测，筛选可能与直肠癌放疗抗拒相关的miRNA。
结果：
1.接种直肠癌组织10天后发现PDX模型的构建成功率为76.79%(43/56)，在43只荷瘤裸鼠的肩部/臀部共形成55个肿瘤，移植瘤的最大直径约为8mm-16mm(1.0±0.45)，中位值为11mm。
2.依据放射治疗后直肠癌组织学退缩分级(RCRG)标准评价移植瘤对辐射的反应，结果发现RCRG1级的标本11例，RCRG2级的标本26例，RCRG3级的标本6例。
3.miRNA芯片检测结果显示共有14个foldchange值＞2.0的miRNA，其中在对辐射抗拒的肿瘤组织中表达上调的有4个分别是miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p；下调有10个分别是miRNA-3138、miRNA-4800-5p、miRNA-6510-5p、miRNA-7847-3p、miRNA-345-3p、miRNA-1236-5p、miRNA-6775-5p、miRNA-1273g-3p、miRNA-145-5p、miRNA-381-3p，进一步在直肠癌组织中进行qRT-PCR验证显示miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p、miRNA-3138、miRNA-381-3p、miRNA-1236-5p、miRNA-145-5p的验证结果与miRNA芯片筛选获得的结果具有相同的趋势。
4.辐射干扰下的克隆形成实验结果显示5个直肠癌细胞系对放射线的抗拒性由强到弱依次为HR-8348＞HRC-99＞RCM-1＞SW837＞SW1463。
5.对与辐射抗拒性呈正相关的4个miRNA在5个直肠癌细胞系中的qRT-PCR验证结果显示只有miRNA-96-5p的表达量与这5个直肠癌细胞系对辐射的抗拒能力的趋势一致。
小结：在直肠癌组织中miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p的表达与术前新辅助放化疗的抗拒呈正相关，miRNA-96-5p在5个直肠癌细胞系中的表达水平变化与细胞对辐射的抗拒趋势一致，是我们进行后续研究的重点指标。
第二部分miRNA-96-5p调控直肠癌HR-8348细胞株放疗抗拒的靶基因筛选及其对经典Wnt信号转导通路影响的分析
目的：检测miRNA-96-5p的表达变化对直肠癌HR-8348细胞系辐射抗拒性以及细胞功能的影响，筛选并验证其调控的靶基因，并对其表达水平差异对Wnt信号传导通路的影响进行研究。
方法：
1.通过慢病毒包装技术及细胞转染技术构建miRNA-96-5p表达稳定下调的HR-8348细胞株，传代培养后进行辐射干扰下的克隆形成实验，进一步检测miRNA-96-5p的表达变化对直肠癌HR-8348细胞株辐射抗拒能力的影响。
2.通过细胞功能实验检测miRNA-96-5p表达变化对直肠癌HR-8348细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。
3.通过生物信息软件TargetScan，miRDB，miRTarbase，Tarbase预测可能受miRNA-96-5p调控的靶基因，并筛选出在这4个生物信息软件中均能预测到的靶基因，之后使用Pubmed医学文献检索服务系统对与上述基因相关联的文献进行查询，继而筛选出与肿瘤的生物学行为相关的靶基因。
4.使用qRT-PCR技术和Westrenblot(WB)技术，检测上述筛选出的靶基因在miRNA-96-5p下调前后在HR-8348细胞株中的表达情况，继而筛选出miRNA-96-5p调控直肠癌HR-8348细胞株放疗抗拒性变化的可能的靶基因，并通过双荧光素酶检测验证miRNA-96-5p是否能直接调控该基因的表达。
5.根据miRNA芯片结果获得的差异miRNA富集通路KEGG预测结果的提示，对既往研究结果证实的与辐射抗拒性关联较密切的经典Wnt信号转导通路上的相关基因的表达进行了Westrenblot分析。
结果：
1.慢病毒载体滴度转染结果显示LV10N-has-miR-96-5p-NC和LV10N-has-miR-96-5p-inhibitor的病毒滴度分别为8×108TU/ml和9×109TU/ml，慢病毒质粒转染HR-8348细胞后检测miRNA-96-5p在各组细胞中的相对表达，结果显示miRNA-96-5p-inhibitor-HR-8348细胞(inhibitor组)明显低于阴性对照(negative control, NC)组和contral组，差异具有统计学意义(5.746±0.451vs.0.0036±0.00095，P＜0.01)；辐射干扰下的克隆形成实验结果显示inhibitor组比control组细胞株对辐射的抗拒性降低(P＜0.001)。
2.细胞功能实验发现inhibitor组的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均明显低于NC组和control组。
3.使用生物信息软件TargetScan、miRDB、miRTarbase、Tarbase共预测得到可能受miRNA-96-5p调控的3428个基因，其中在这4个生物信息软件中均能预测到的靶基因共10个，分别是CAV1、DAB2、DDIT3、EDEM1、FOXO3、CPC3、MBD4、PDCD4、SLC25A25、ZEB1。应用Pubmed医学文献检索服务系统检索上述基因研究的相关文献，发现上述既往报道过与肿瘤的生物学行为相关的基因共有7个，分别是CAV1、DAB2、DDIT3、FOXO3、GPC3、MBD4、PDCD4基因。
4.分别采用qRT-PCR技术和WB技术对上述可能的靶基因的表达水平在转染前后的直肠癌HR-8348中进行检测，在本研究中我们把通过上述两种方法发现的在inhibitor组中表达水平比NC组和control组均明显上调的基因作为进一步研究的目的基因。qRT-PCR结果显示在inhibitor组、NC组、control组中CAV1、DDIT3、PDCD4的表达没有发现统计学差异(P＞0.05)，DAB2和MBD4在inhibitor组中的表达水平显著低于较NC组和contral组(P＜0.05)，FOXO3和GPC3在inhibitor组中的表达水平较NC组和control组显著增高(P＜0.05)；WB结果显示CAV1、DDIT3、PDCD4、MBD4的表达在三组细胞株中没有发现统计学差异(P＞0.05)，DAB2在inhibitor组中的表达较NC组和control组均显著减低(P＜0.05)；FOXO3在inhibitor组和NC组中的表达未见明显差异，但显著高于control组(P＜0.05)，GPC3在转染组中的表达较NC组和control组均显著增高(P＜0.05)，综合分析上述结果发现在上述7个基因中只有GPC3符合在qRT-PCR和WB检测两种方法中的表达在inhibitor组中明显上调的标准，因此在本研究中我们将GPC3基因视为在HR-8348细胞中受miRNA-96-5p调控的靶基因。
5.为了验证GPC3基因在直肠癌HR-8348细胞株中是否能直接受到miRNA-96-5p的调控，我们进行了双荧光酶检测，结果发现GPC3的mRNA3’UTR端是miRNA-95-5p直接靶点，miRNA-95-5p能够通过直接靶向GPC3mRNA3’UTR端而下调其在直肠癌HR-8348细胞中的表达。
6.采用WB检测转染前后直肠癌HR-8348细胞中经典Wnt信号转导通路上的相关基因的表达，发现该通路的枢纽分子β-catenin在三组细胞中的总表达量差异不明显，但在inhibitor组细胞浆中的表达量明显低于NC组和contral组的胞浆内表达，在inhibitor组中β-catenin细胞浆与全细胞表达量的比值明显低于NC组和contral组的比值；对β-catenin降解复合体的关键分子GSK3β及其磷酸化分子p-GSK3β进行检测，发现在三组细胞中GSK3β的表达差异不明显，但p-GSK3β在inhibitor组中的表达量明显低于NC组和contral组，在inhibitor组中p-GSK3β与GSK3β表达量的比值低于NC组和contral组的比值，提示在对miRNA-95-5p进行抑制后GSK3β的磷酸化水平降低；进一步对经典Wnt信号通路的下游基因CD44和c-myc的表达进行检测，发现这两个基因在inhibitor组的表达较在NC组和contral组中的表达均明显下调，提示miRNA-96-5p在直肠癌HR-8348细胞中的下调抑制了经典Wnt信号传导通路的活性。
小结：miRNA-96-5p的高表达是导致直肠癌HR-8348细胞辐射抗拒性高的重要因素，GPC3基因是受其直接调控的靶基因，对miRNA-96-5p的抑制能够使经典Wnt信号传导通路的活性降低，受miRNA-96-5p调控的GPC3基因可能参与了Wnt信号传导通路活性变化。
第三部分局部进展期中低位直肠癌术前同期放化疗反应性相关临床因素筛选
目的：术前同期放化疗(concurrent chemoradiotherapy, CCRT)作为局部进展期期直肠癌(local advanced rectal cancer, LARC)的标准治疗方法，在临床中已得到了广泛的应用，其疗效影响着患者的预后及后续治疗方案的选择。目前对于那些对术前CCRT敏感的LRAC患者，后续的治疗选择包括在CCRT治疗后8-10周进行全直肠系膜切除术(total mesorectal resection, TME)和采用“等待与观察”的策略。但是那些对CCRT敏感性低或抗拒的患者，如果接受了这种治疗方法，不但不能受益，反而会由于辐射的副反应及并发症而造成手术操作和术后恢复的困难；此外，由于完成术前CCRT之后患者还需要等待将近8-10周才能进行手术治疗，所以可能会因此延误患者的病情继而影响预后。为了在治疗前能够在临床实践中筛选出对术前CCRT敏感性高的患者以及对术前CCRT抗拒性高的LARC患者以便更好的进行个体化治疗，我们在本研究中对可能影响LARC患者对术前CCRT反应性的多个因素进行筛选，以便临床医生能够在治疗前对患者的CCRT反应能力进行预测和判断，继而为临床实践工作提供参考。
方法：依据入组标准纳入确诊的79例LARC患者，分别以患者接受术前CCRT之后达到pCR和N/LR为因变量，以患者的一般临床特征(年龄、性别、病理分型、临床T分期(clinicaltumorstaging,cT)、临床N分期(clinicallymphnodestaging,cN)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen, CEA))，CCRT前和治疗前肿瘤干细胞标记物CD44v6的表达水平，原发肿瘤病灶的影像体积参数(肿瘤最大长度(tumormaximumlength,TML)、肿瘤最大直径(tumormaximumdiameter,TMD)、肿瘤近似体积(approximate l tumor volume, ATV)、肿瘤真实体积(real tumor volume, RTV)、肿瘤内表面积(tumor surface area Intestinal tube, TSAI)、肿瘤外表面积(tumor surface area outside tube, TSAO)、肿瘤总表面积(total tumor surface area, TSA)、肿瘤致密度(tumor compactness, TC))等15个可能影响LARC患者对术前CCRT反应性的因素作自变量，进行多因素回归分析。
结果：当以患者接受术前CCRT后的pCR状况为因变量时，我们发现LARC患者的pCR状况与TC呈正相关，与ATV、RTV呈负相关。当我们以患者接受术前CCRT后的N/LR状况为因变量时，发现LARC患者的N/LR状况与RTV、TSA、CD44v6表达水平呈正相关，与TC呈负相关。此外，我们根据获得的多因素回归分析结果，分别构建了预测LARC患者对术前CCRT达到pCR和对术前CCRT结果为N/LR状况进行预测的模型，并对阳性预测因子和预测模型的预测价值进行了分析，发现在pCR模型中，预测模型Z1、预测模型Z2、ATV、RTV、TC的敏感性分别为70.00%、65.00%、85.00%、85.00、85.00%，特异性分别为93.22%、94.92%、47.46%、42.37%、89.83%，阳性预测值分别为77.78%、81.27%、35.57%、33.48%、74.73%，阴性预测值分别为90.16%、88.89%、90.27%、89.22%、94.61%；在N/LR模型中，预测模型Z3、预测模型Z4、RTV、TC、TSA的敏感性分别为95.80%、79.17%、62.50%、95.83%、62.5%，特异性分别为70.90%、74.55%、83.64%、47.27%、96.36%，阳性预测值分别为58.96%、57.58%、62.51%、44.23%、88.23%，阴性预测值分别为97.48%、89.13%、83.64%、96.29%和85.48%。
小结：局部进展期直肠癌患者对术前同期放化疗的反应性是可预测的，对于敏感患者其ATV、RTV、TC的值可以作为独立预测因子，对于抗拒患者其CD44v6的表达水平、RTV、TC、TSA的值可以作为独立预测因子，临床医生可以将这些影响因子的数值纳入回归模型，对LARC患者对术前CCRT的反应性进行判断。
结论：
1.在直肠癌组织中miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p的表达与术前新辅助放化疗的抗拒呈正相关；
2.在直肠癌HR-8348细胞中下调miRNA-96-5p的表达量，可导致该细胞株的辐射抗拒能力降低；
3.下调miRNA-96-5p的表达量后，HR-8348细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均受到了抑制，提示miRNA-96-5p与直肠腺癌的侵袭和转移特性相关。
4.在直肠癌HR-8348细胞中GPC3基因是直接受miRNA-96-5p调控的靶基因。
5.在直肠癌HR-8348细胞中miRNA-96-5p对经典Wnt信号转导通路存在调控作用，该作用与直肠癌患者对辐射的反应性有关。
6.原发肿瘤病灶的体积影像参数ATV、RTV、TC、TSA以及肿瘤干细胞标记物CD44v6的表达状况对于预测局部进展期直肠癌患者对术前CCRT的反应性具有重要价值。
目的：构建中低位局部进展期直肠癌人源性肿瘤动物模型(patient-derived xenograft, PDX)并对荷瘤裸鼠和5个直肠癌细胞株的放疗反应能力进行检测，筛选出与辐射抗拒呈正相关miRNA和辐射抗拒的直肠癌细胞株。
方法：
1.于术中自河北医科大学第四医院外二科获得中低位局部进展期直肠癌患者的新鲜手术肿瘤组织标本，将标本锐性分离为两等份：其中一份冻存于-150℃冰箱内，另一份接种于荷兰裸鼠肩部/臀部构建PDX模型。
2.采用单次16Gy的辐射剂量照射PDX模型的肿瘤部位，于辐射后10天测量移植瘤的体积并处死荷瘤鼠、剥离瘤组织进行HE染色，评价移植瘤对辐射反应情况。
3.根据移植瘤对辐射反应的评价结果，筛选出接受辐射后肿瘤组织学达到病理完全反应(pathologic complete response, pCR)的标本和无/低反应(no/low response, N/L R)的标本各3例，将与其对应的冻存于-150℃冰箱内的标本进行miRNA芯片检测，筛选出差异表达foldchange值＞2.0的miRNA，并采用qRT?PCR检测方法对筛选出的差异miRNA在直肠癌组织中进行验证。
4.传代培养直肠腺癌HRC?99、HR?8348、SW1463、SW837、RCM?1细胞系，将这5种细胞按照一定数量分别种植于培养皿，待细胞贴壁后分别进行单次剂量为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的放射线照射，进行辐射干扰下的克隆形成实验，继而筛选出对辐射抗拒的细胞株。
5.根据miRNA芯片的筛选结果和组织验证的结果，采用qRT?PCR技术，对可能导致直肠癌辐射抗拒性增高的miRNA在上述5个直肠癌细胞系中的表达量进行检测，筛选可能与直肠癌放疗抗拒相关的miRNA。
结果：
1.接种直肠癌组织10天后发现PDX模型的构建成功率为76.79%(43/56)，在43只荷瘤裸鼠的肩部/臀部共形成55个肿瘤，移植瘤的最大直径约为8mm-16mm(1.0±0.45)，中位值为11mm。
2.依据放射治疗后直肠癌组织学退缩分级(RCRG)标准评价移植瘤对辐射的反应，结果发现RCRG1级的标本11例，RCRG2级的标本26例，RCRG3级的标本6例。
3.miRNA芯片检测结果显示共有14个foldchange值＞2.0的miRNA，其中在对辐射抗拒的肿瘤组织中表达上调的有4个分别是miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p；下调有10个分别是miRNA-3138、miRNA-4800-5p、miRNA-6510-5p、miRNA-7847-3p、miRNA-345-3p、miRNA-1236-5p、miRNA-6775-5p、miRNA-1273g-3p、miRNA-145-5p、miRNA-381-3p，进一步在直肠癌组织中进行qRT-PCR验证显示miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p、miRNA-3138、miRNA-381-3p、miRNA-1236-5p、miRNA-145-5p的验证结果与miRNA芯片筛选获得的结果具有相同的趋势。
4.辐射干扰下的克隆形成实验结果显示5个直肠癌细胞系对放射线的抗拒性由强到弱依次为HR-8348＞HRC-99＞RCM-1＞SW837＞SW1463。
5.对与辐射抗拒性呈正相关的4个miRNA在5个直肠癌细胞系中的qRT-PCR验证结果显示只有miRNA-96-5p的表达量与这5个直肠癌细胞系对辐射的抗拒能力的趋势一致。
小结：在直肠癌组织中miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p的表达与术前新辅助放化疗的抗拒呈正相关，miRNA-96-5p在5个直肠癌细胞系中的表达水平变化与细胞对辐射的抗拒趋势一致，是我们进行后续研究的重点指标。
第二部分miRNA-96-5p调控直肠癌HR-8348细胞株放疗抗拒的靶基因筛选及其对经典Wnt信号转导通路影响的分析
目的：检测miRNA-96-5p的表达变化对直肠癌HR-8348细胞系辐射抗拒性以及细胞功能的影响，筛选并验证其调控的靶基因，并对其表达水平差异对Wnt信号传导通路的影响进行研究。
方法：
1.通过慢病毒包装技术及细胞转染技术构建miRNA-96-5p表达稳定下调的HR-8348细胞株，传代培养后进行辐射干扰下的克隆形成实验，进一步检测miRNA-96-5p的表达变化对直肠癌HR-8348细胞株辐射抗拒能力的影响。
2.通过细胞功能实验检测miRNA-96-5p表达变化对直肠癌HR-8348细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。
3.通过生物信息软件TargetScan，miRDB，miRTarbase，Tarbase预测可能受miRNA-96-5p调控的靶基因，并筛选出在这4个生物信息软件中均能预测到的靶基因，之后使用Pubmed医学文献检索服务系统对与上述基因相关联的文献进行查询，继而筛选出与肿瘤的生物学行为相关的靶基因。
4.使用qRT-PCR技术和Westrenblot(WB)技术，检测上述筛选出的靶基因在miRNA-96-5p下调前后在HR-8348细胞株中的表达情况，继而筛选出miRNA-96-5p调控直肠癌HR-8348细胞株放疗抗拒性变化的可能的靶基因，并通过双荧光素酶检测验证miRNA-96-5p是否能直接调控该基因的表达。
5.根据miRNA芯片结果获得的差异miRNA富集通路KEGG预测结果的提示，对既往研究结果证实的与辐射抗拒性关联较密切的经典Wnt信号转导通路上的相关基因的表达进行了Westrenblot分析。
结果：
1.慢病毒载体滴度转染结果显示LV10N-has-miR-96-5p-NC和LV10N-has-miR-96-5p-inhibitor的病毒滴度分别为8×108TU/ml和9×109TU/ml，慢病毒质粒转染HR-8348细胞后检测miRNA-96-5p在各组细胞中的相对表达，结果显示miRNA-96-5p-inhibitor-HR-8348细胞(inhibitor组)明显低于阴性对照(negative control, NC)组和contral组，差异具有统计学意义(5.746±0.451vs.0.0036±0.00095，P＜0.01)；辐射干扰下的克隆形成实验结果显示inhibitor组比control组细胞株对辐射的抗拒性降低(P＜0.001)。
2.细胞功能实验发现inhibitor组的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均明显低于NC组和control组。
3.使用生物信息软件TargetScan、miRDB、miRTarbase、Tarbase共预测得到可能受miRNA-96-5p调控的3428个基因，其中在这4个生物信息软件中均能预测到的靶基因共10个，分别是CAV1、DAB2、DDIT3、EDEM1、FOXO3、CPC3、MBD4、PDCD4、SLC25A25、ZEB1。应用Pubmed医学文献检索服务系统检索上述基因研究的相关文献，发现上述既往报道过与肿瘤的生物学行为相关的基因共有7个，分别是CAV1、DAB2、DDIT3、FOXO3、GPC3、MBD4、PDCD4基因。
4.分别采用qRT-PCR技术和WB技术对上述可能的靶基因的表达水平在转染前后的直肠癌HR-8348中进行检测，在本研究中我们把通过上述两种方法发现的在inhibitor组中表达水平比NC组和control组均明显上调的基因作为进一步研究的目的基因。qRT-PCR结果显示在inhibitor组、NC组、control组中CAV1、DDIT3、PDCD4的表达没有发现统计学差异(P＞0.05)，DAB2和MBD4在inhibitor组中的表达水平显著低于较NC组和contral组(P＜0.05)，FOXO3和GPC3在inhibitor组中的表达水平较NC组和control组显著增高(P＜0.05)；WB结果显示CAV1、DDIT3、PDCD4、MBD4的表达在三组细胞株中没有发现统计学差异(P＞0.05)，DAB2在inhibitor组中的表达较NC组和control组均显著减低(P＜0.05)；FOXO3在inhibitor组和NC组中的表达未见明显差异，但显著高于control组(P＜0.05)，GPC3在转染组中的表达较NC组和control组均显著增高(P＜0.05)，综合分析上述结果发现在上述7个基因中只有GPC3符合在qRT-PCR和WB检测两种方法中的表达在inhibitor组中明显上调的标准，因此在本研究中我们将GPC3基因视为在HR-8348细胞中受miRNA-96-5p调控的靶基因。
5.为了验证GPC3基因在直肠癌HR-8348细胞株中是否能直接受到miRNA-96-5p的调控，我们进行了双荧光酶检测，结果发现GPC3的mRNA3’UTR端是miRNA-95-5p直接靶点，miRNA-95-5p能够通过直接靶向GPC3mRNA3’UTR端而下调其在直肠癌HR-8348细胞中的表达。
6.采用WB检测转染前后直肠癌HR-8348细胞中经典Wnt信号转导通路上的相关基因的表达，发现该通路的枢纽分子β-catenin在三组细胞中的总表达量差异不明显，但在inhibitor组细胞浆中的表达量明显低于NC组和contral组的胞浆内表达，在inhibitor组中β-catenin细胞浆与全细胞表达量的比值明显低于NC组和contral组的比值；对β-catenin降解复合体的关键分子GSK3β及其磷酸化分子p-GSK3β进行检测，发现在三组细胞中GSK3β的表达差异不明显，但p-GSK3β在inhibitor组中的表达量明显低于NC组和contral组，在inhibitor组中p-GSK3β与GSK3β表达量的比值低于NC组和contral组的比值，提示在对miRNA-95-5p进行抑制后GSK3β的磷酸化水平降低；进一步对经典Wnt信号通路的下游基因CD44和c-myc的表达进行检测，发现这两个基因在inhibitor组的表达较在NC组和contral组中的表达均明显下调，提示miRNA-96-5p在直肠癌HR-8348细胞中的下调抑制了经典Wnt信号传导通路的活性。
小结：miRNA-96-5p的高表达是导致直肠癌HR-8348细胞辐射抗拒性高的重要因素，GPC3基因是受其直接调控的靶基因，对miRNA-96-5p的抑制能够使经典Wnt信号传导通路的活性降低，受miRNA-96-5p调控的GPC3基因可能参与了Wnt信号传导通路活性变化。
第三部分局部进展期中低位直肠癌术前同期放化疗反应性相关临床因素筛选
目的：术前同期放化疗(concurrent chemoradiotherapy, CCRT)作为局部进展期期直肠癌(local advanced rectal cancer, LARC)的标准治疗方法，在临床中已得到了广泛的应用，其疗效影响着患者的预后及后续治疗方案的选择。目前对于那些对术前CCRT敏感的LRAC患者，后续的治疗选择包括在CCRT治疗后8-10周进行全直肠系膜切除术(total mesorectal resection, TME)和采用“等待与观察”的策略。但是那些对CCRT敏感性低或抗拒的患者，如果接受了这种治疗方法，不但不能受益，反而会由于辐射的副反应及并发症而造成手术操作和术后恢复的困难；此外，由于完成术前CCRT之后患者还需要等待将近8-10周才能进行手术治疗，所以可能会因此延误患者的病情继而影响预后。为了在治疗前能够在临床实践中筛选出对术前CCRT敏感性高的患者以及对术前CCRT抗拒性高的LARC患者以便更好的进行个体化治疗，我们在本研究中对可能影响LARC患者对术前CCRT反应性的多个因素进行筛选，以便临床医生能够在治疗前对患者的CCRT反应能力进行预测和判断，继而为临床实践工作提供参考。
方法：依据入组标准纳入确诊的79例LARC患者，分别以患者接受术前CCRT之后达到pCR和N/LR为因变量，以患者的一般临床特征(年龄、性别、病理分型、临床T分期(clinicaltumorstaging,cT)、临床N分期(clinicallymphnodestaging,cN)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen, CEA))，CCRT前和治疗前肿瘤干细胞标记物CD44v6的表达水平，原发肿瘤病灶的影像体积参数(肿瘤最大长度(tumormaximumlength,TML)、肿瘤最大直径(tumormaximumdiameter,TMD)、肿瘤近似体积(approximate l tumor volume, ATV)、肿瘤真实体积(real tumor volume, RTV)、肿瘤内表面积(tumor surface area Intestinal tube, TSAI)、肿瘤外表面积(tumor surface area outside tube, TSAO)、肿瘤总表面积(total tumor surface area, TSA)、肿瘤致密度(tumor compactness, TC))等15个可能影响LARC患者对术前CCRT反应性的因素作自变量，进行多因素回归分析。
结果：当以患者接受术前CCRT后的pCR状况为因变量时，我们发现LARC患者的pCR状况与TC呈正相关，与ATV、RTV呈负相关。当我们以患者接受术前CCRT后的N/LR状况为因变量时，发现LARC患者的N/LR状况与RTV、TSA、CD44v6表达水平呈正相关，与TC呈负相关。此外，我们根据获得的多因素回归分析结果，分别构建了预测LARC患者对术前CCRT达到pCR和对术前CCRT结果为N/LR状况进行预测的模型，并对阳性预测因子和预测模型的预测价值进行了分析，发现在pCR模型中，预测模型Z1、预测模型Z2、ATV、RTV、TC的敏感性分别为70.00%、65.00%、85.00%、85.00、85.00%，特异性分别为93.22%、94.92%、47.46%、42.37%、89.83%，阳性预测值分别为77.78%、81.27%、35.57%、33.48%、74.73%，阴性预测值分别为90.16%、88.89%、90.27%、89.22%、94.61%；在N/LR模型中，预测模型Z3、预测模型Z4、RTV、TC、TSA的敏感性分别为95.80%、79.17%、62.50%、95.83%、62.5%，特异性分别为70.90%、74.55%、83.64%、47.27%、96.36%，阳性预测值分别为58.96%、57.58%、62.51%、44.23%、88.23%，阴性预测值分别为97.48%、89.13%、83.64%、96.29%和85.48%。
小结：局部进展期直肠癌患者对术前同期放化疗的反应性是可预测的，对于敏感患者其ATV、RTV、TC的值可以作为独立预测因子，对于抗拒患者其CD44v6的表达水平、RTV、TC、TSA的值可以作为独立预测因子，临床医生可以将这些影响因子的数值纳入回归模型，对LARC患者对术前CCRT的反应性进行判断。
结论：
1.在直肠癌组织中miRNA-552-3p、miRNA-96-5p、miRNA-182-5p、miRNA-183-5p的表达与术前新辅助放化疗的抗拒呈正相关；
2.在直肠癌HR-8348细胞中下调miRNA-96-5p的表达量，可导致该细胞株的辐射抗拒能力降低；
3.下调miRNA-96-5p的表达量后，HR-8348细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均受到了抑制，提示miRNA-96-5p与直肠腺癌的侵袭和转移特性相关。
4.在直肠癌HR-8348细胞中GPC3基因是直接受miRNA-96-5p调控的靶基因。
5.在直肠癌HR-8348细胞中miRNA-96-5p对经典Wnt信号转导通路存在调控作用，该作用与直肠癌患者对辐射的反应性有关。
6.原发肿瘤病灶的体积影像参数ATV、RTV、TC、TSA以及肿瘤干细胞标记物CD44v6的表达状况对于预测局部进展期直肠癌患者对术前CCRT的反应性具有重要价值。