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苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养期杀虫蛋白(VegetativeInsecticidal Proteins,VIPs)对鳞翅目昆虫具有广谱的杀虫活性,且与Bt杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)作用机理不同。因而,分离克隆新型高毒力的营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)基因对于构建高效广谱的基因工程微生物和培育转基因抗虫植物、控制害虫抗性发展都具有重要的意义。本研究以本实验室特有的Bt菌为材料,利用分子鉴定和生物测定相结合的方法,得到了营养期活性较高的Bt LS1和Bt LS8菌株,并系统地开展了两菌株的分子生物学研究。结果如下: 本研究对本实验室分离得到的99株Bt野生型菌株进行vip3A基因鉴定。在55株野生菌中扩增得到了1.2 kb的PCR产物,约有55.6%的菌株含有vip3A基因。其中LS1和LS8菌株引物扩增实验均检测到了靶片断。对31株含有vip3A基因的Bt野生型菌株进行了生物活性测定,得到了营养期对棉铃虫活性较高的菌株LS1和LS8。高毒力野生菌株LS1和LS8菌株在培养特性上与标准菌株HD-1基本相同。营养期培养物对初孵棉铃虫有很好的毒杀作用,对二龄棉铃虫生长有较好的抑制作用,其中LS8菌株上清液处理对初孵和二龄幼虫的死亡率和体重抑制率分别达到(50.3+3.7)%和(50.4+2.4)%,LS1菌株对二龄幼虫的体重抑制率达到(78.7±6.6)%;LS1和LS8菌株上清液处理对甜菜夜蛾未表现杀虫活性,胞内活性物质对甜菜夜蛾有很强的抑制作用,体重抑制率分别达到45.13%和43.20%。热处理试验表明,营养期培养物中活性成分具有热不稳定性。分子鉴定和生物测定结果说明两菌株中营养期杀虫活性物质为营养期杀虫蛋白。 选取对棉铃虫高毒力的LS1和LS8菌株进行营养期杀虫蛋白基因的克隆研究。通过碱裂解法提取质粒为模板,进行全长基因PCR,酶切后与同样酶切的克隆载体pBluescript SK(+)连接,经鉴定得到了重组质粒pSV113和pSV116。测序结果经网上比对分析证实为vip3A类基因,软件分析表明,Vip3A-LS1蛋白分子量为88.6kD,等电点为4.965,Vip3A-LS8蛋白分子量为88.6kD,等电点为4.865;两基因与vip3A(a)的同源性为99.8%,与AF548629的同源性最小,分别为98.7%和98.6%,两基因为新的vip3A类基因,分别定名为vip3A-LS1和vip3A-LS8,提交GenBank中登记注册,登录号为DQ016968,DQ016969。 构建了两营养期杀虫蛋白基因(vip3A-LS1和vip3d-LS8)的表达载体,并在E.coli BL21中实现了两种杀虫蛋白的大量表达。生长曲线结果表明诱导重组菌BPV113和BPV116较同处理的非诱导菌,生长速度明显减慢,SDS-PAGE检测与非诱导菌相比,均得到了约88kD的蛋白条带,说明蛋白得到了表达。 对营养期杀虫蛋白基因表达产物进行了室内生物活性测定。Vip3A-LS1蛋白对棉铃虫幼虫进行生物活性测定,棉铃虫平均死亡率为58.6%。与同处理空载茵相比体重抑制率为90.3%。对甜菜夜蛾幼虫进行生物活性测定,甜菜夜蛾平均死亡率为68.2%。与同处理的空载菌相比体重抑制率达到99.1%。 Vip3A-LS8蛋白对棉铃虫幼虫进行生物活性测定,棉铃虫平均死亡率为