研究背景高血压(Hypertension, HT)是一种以动脉血压升高为主要特征的全身性疾病,是目前临床上最常见、最重要的心血管疾病之一。虽然目前在高血压的发病机制和治疗方面已经取得了巨大的成就,但仍有很多患者的血压得不到理想的控制,提示在高血压发生发展过程中可能还有其它因素的参与。近年来的研究发现,在恶性高血压、原发性高血压和难治性高血压患者血清中存在有针对α1-肾上腺素受体细胞外第二环(α1-AR-ECⅡ)的自身抗体(α1-AA),该自身抗体可以使培养的乳鼠心肌细胞搏动频率加快,使心肌细胞膜上L-钙通道激活。此外,我们的前期工作还观察到α1-AA可以通过激活α1-肾上腺素受体增加离体大鼠胸主动脉的张力和重要脏器微血管的张力。这些研究强烈提示α1-AA可能与高血压疾病的发生发展密切相关,但目前的研究主要聚焦于α1A受体的自身抗体((α1A-AA),而αl-肾上腺素受体(α1-AR)主要分为α1A、α1B-1B、α1D三种亚型。已有研究发现,在人和大鼠主动脉分布的α1-AR亚型主要是α1D-AR,α1D对大动脉及小动脉收缩都起重要作用,参与了高血压的发生发展,所以高血压患者体内α1D受体自身抗体(α1D.AA)的有无及其与疾病的关系值得关注。但目前要解决上述问题尚需要完成大量的基础研究工作。首先,已有的检测α1-AA的试剂盒是用于检测抗α1A-AR自身抗体的。因此,建立一种针对α1D-AR亚型自身抗体的检测试剂盒,是进行αD-AA研究所必备的基础条件。其次,α1D-AA的病理生理意义有待进一步确定。本研究小组前期用合成的α1D-AR-ECⅡ肽段主动免疫正常大鼠,虽然并未导致高血压形成,免疫大鼠的血管内皮功能发生了损伤。然而,这种血管内皮功能损伤并不能区别是由于抗原本身的作用,还是由α1D-AA所引起。此外,高血压发病过程中存在免疫系统激活的现象,但原因不清。已知T淋巴细胞在免疫应答起始阶段起着必不可少的辅助作用,T淋巴细胞增殖是机体对抗原刺激产生免疫应答过程中的一个重要阶段。有研究表明,T淋巴细胞膜上存在α1D-AR,那么,α1D-AA除了先前所发现的对心血管的作用外,是否可以与T淋巴细胞膜上的相应受体结合,进而影响机体的免疫调节功能呢?为了回答上述问题,我们设计了本研究课题：(1)根据ELISA方法的原理,设计和研制针对高血压患者α1D-AA的抗体测定试剂盒；(2)将α1D.AA转运至正常大鼠,检测前期研究观察到的α1D-AR-ECⅡ主动免疫大鼠造成的血管内皮损伤等现象是否由α1D-AA所引起；(3)制备高血压大鼠模型,检测模型鼠免疫状态,并从离体水平观察α1D-AA对T淋巴细胞的直接作用。研究目的1.建立并优化检测α1D-AA的间接酶联免疫吸附(ELISA)测定方法和条件。2.观察α1D-AA长期被动免疫对大鼠的血压和血管内皮的损伤情况。3.观察α1-AA是否可以与T淋巴细胞膜上的相应受体结合,进而影响机体的免疫调节功能?研究方法1.以合成的人α1D-肾上腺素受体(α1D-adrenoceptor,α1D-AR)细胞外第二环功能表位肽段(第192-218位氨基酸残基)为特异性抗原,建立间接ELISA测定方法,并用该法检测100例血压正常者和69例原发性高血压患者血清中抗α1D-AA。2.用α1D-AA长期被动免疫正常大鼠,观察该类抗体对大鼠血压的直接影响；通过血管环张力测定技术,观察ααlD-AA长期存在下,大鼠离体胸主动脉血管舒缩活动的改变；以血清中内皮素-1(ET-1)含量为指标,观察在该抗体长期作用下,血管内皮的损伤情况。3.采用两肾一夹(2K1C)法制备高血压大鼠模型,模型成功后,定期检测血清中α1D-AA的抗体滴度；并检测抗体生成能力；培养肠系膜淋巴结细胞,采用CCK-8检测试剂盒,观察α1D-AA对刀豆球蛋白A(ConcanavalinA,Con A)刺激的T淋巴细胞增殖功能的影响。研究结果1.α1D-AA试剂盒的建立及初步应用该实验方法中确定的最适抗原工作浓度为2.5mg/L,生物素化山羊抗人IgG的工作浓度为1：1500,SA-HRP的工作浓度为1：750。用我们建立的试剂盒,将α1D-AA阳性对照血清和阴性对照血清重复测定20次,其批内变异系数分别为5.8%和4.2%；连续测定20天的批间变异系数分别为12.7%和9.8%,提示本方法具有较好的重复性和稳定性。特异性吸收试验结果表明(图1-1),以人工合成的ααlD-AR细胞外第二环相应的抗原肽段吸收阳性血清后,使平均OD值下降了2／3；而使用PMT吸收阳性血清后,没有使该抗体水平下降。提示,本法具有较强的特异性。用该试剂盒测定原发性高血压患者血清中α1D-AA,其阳性率为23.2%(16／69),明显高于血压正常者血清的阳性率9%(9／100),(P<0.05,表1-2)。2.被动免疫正常大鼠后α1D-AA抗体滴度的变化给正常大鼠经尾静脉被动转入α1D-AA后,大鼠血清中α1D-AA水平迅速升高,随后保持在一个较平稳的水平。被动免疫组1、2、3、4月之间比较无统计学差异,但和对照组相比均有显著差异(均为P<0.05)。在整个被动免疫过程中,免疫大鼠血清中α1D-AA水平维持在0.43±0.13-0.49±0.11之间,提示α1D-AA被动免疫模型制备成功(图2-1)。3.被动免疫正常大鼠后血压的变化被动免疫之前大鼠免疫组和对照组的平均血压分别为105±5.4mmHg和104±4.4mmHg,两者相比无统计学差异(P>0.05)。第2周时免疫组大鼠血压有所升高,第4周时血压一过性升高达125±6.9mmHg,明显高于免疫对照组(P<0.05),并维持到第6周(125±7.3mmHg),随后血压回落到被动免疫前的水平。而免疫对照组大鼠血压在整个免疫过程中无明显变化(图2-2)。4.被动免疫正常大鼠血清中ET-1的变化采用ELISA法定量测定大鼠血清中ET-1的含量。研究结果显示,被动免疫组大鼠在免疫后4周血清中ET-1含量便开始增高(12.0±1.4),12周时达高峰(21.0±1.6),与对照组(11.0±1.1)相比有显著性差异(P<0.05)。至免疫结束时,免疫组ET-1仍保持在较高的水平(16.3±0.6),(P<0.05，vs.同期对照组,图2-3)。提示α1D-AA可能持续地引起了血管内皮损伤。5.被动免疫正常大鼠血管反应性的变化采用离体血管环的方法测定大鼠胸主动脉的舒缩功能。研究结果显示,随着去氧肾上腺素(PE)浓度的升高,离体大鼠胸主动脉血管环的收缩幅度逐渐增加,在PE浓度为10-7mol/L和10-6mol/L时,被动免疫组大鼠的血管收缩作用较对照组均增强,两组相比有显著性差异(P均小于0.05,图2-4)；尽管如此,被动免疫组大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能却弱于免疫对照组,当Ach浓度为10-6mol/L和10-5mol/L时,两组大鼠的血管舒张程度均有显著性差异(P<0.05,P<0.05,图2-5)。6.2K1 C手术后大鼠血压的变化情况2K1C手术前手术组和伪手术组的血压分别为114.8±3.9mmHg和114.3±3.3mmHg;手术2周后手术组大鼠血压升高(134.3±8.7mmHg),显著高于同期伪手术组(116.2±3.9nmHg)(两组相比P<0.05)；在术后4周时手术组大鼠血压达到高峰(141.5±10.5mmHg),(P<0.01，vs同期对照组)；并且在术后16周时手术组大鼠血压仍维持在较高水平(137.6±7.4mmHg,P<0.01，vs.同期伪手术组,图3-1)。提示,高血压模型制备成功。7.2K1C手术后大鼠血清中α1D.AA的生成2K1C手术后2周手术组大鼠血清中α1D.AA含量即升高(0.19±0.02),显著高于伪手术组(0.15±0.01,P<0.01)；4周后手术组大鼠血清中α1D.AA含量达到高峰(0.21±0.01,P<0.01，vs.同期伪手术组)；并持续到第12周(0.21±0.01,P<0.01，vs.同期伪手术组),之后开始下降,并于术后16周降至术前水平(0.16±0.01,图3-2)。提示,在高血压形成过程中有α1D.AA的生成,并呈一定的规律性。8.高血压大鼠模型中抗体生成能力的改变采用直接溶血空斑实验来测定两周时2K1C大鼠脾淋巴细胞的功能(即抗体生成能力),结果表明,2K1C大鼠直接溶血空斑数量明显升高(2.5±0.01,P<0.01，vs.伪手术组,图3-3)。提示,2K1C术后大鼠在血压升高过程中出现免疫系统抗体生成能力的增强。9.αDo-AA对T淋巴细胞增殖功能的影响经CCK-8试剂盒检测结果显示,三个浓度的α1D-AA(0.01unol/L,0.1μmol/L,1μmol/L)均可以促进Con A激活的T淋巴细胞增殖,并呈浓度依赖性趋势(OD值分别为0.49±0.05,0.69±0.08,0.82±0.07),该作用类似于α1-AR激动剂去氧肾上腺素的效应。此外,α1D-AA的作用可被α1D-AR特异性阻断剂布那唑嗪和α1D.AR细胞外第二环的抗原肽段所中和,而单纯的布那唑嗪或α1D.AR抗原肽段对T淋巴细胞的增殖功能无明显影响(图3-4)。提示α1D-AA对T淋巴细胞的增殖有促进作用。结论1.本研究建立的α1D-AA检测的间接ELISA方法具有较强的特异性以及良好的重复性和稳定性。2.α1D-AA被动免疫大鼠,可以引起大鼠血压一过性的升高,但并不能导致高血压的形成。而该抗体长期存在时,可以导致大鼠血管内皮功能损伤。3.大鼠模型中抗体的生成能力增强,生成的α1D-AA可促进T淋巴细胞的增殖,这可能会使免疫系统进一步紊乱,从而恶化高血压的发生发展。