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’云香’水仙(Narcissus tazettavar.’Yunxiang’)[1-2]是福建农林大学园艺遗传育种研究所选育的多花水仙新品种,2012年4月1日通过福建省农作物品种审定委员会认定,与其他水仙品种相比,’云香’水仙花朵大、花朵数量多、花期长、香气浓,花葶挺立,可用作切花。但是切花对贮藏保鲜和花期要求很高。本研究从’云香’水仙花瓣中分离乙烯生物合成途径关键酶基因ACS和ACO基因,对其进行表达分析和载体构建,并通过农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株,为进一步鉴定所分离基因功能和后续转化水仙提供试验基础。最终通过基因工程调节乙烯代谢途径来获得更长贮藏保鲜期的’云香’水仙,以拓展多花水仙的用途,使其更适于用作鲜切花。本研究主要结果如下:1.探究了多花水仙ACS基因的序列特征及功能,以’云香’水仙盛花期花瓣为试验材料,根据’云香’水仙花朵转录组数据信息,通过RT-PCR方法克隆出1个ACS基因,命名为NtACS1(Genbank登录号为KX082936),其开放阅读框(ORF)长度为552bp,编码183个氨基酸。编码蛋白质分子量约为20.6 kD,理论等电点为6.30,不稳定系数为65.49,属于不稳定的疏水性蛋白。通过qRT-PCR对’云香’水仙不同时期花瓣和副冠中的NtACS1基因进行了表达分析,得到与’云香’水仙花朵转录组数据中相同的结果:NtACS1基因在’云香’水仙花瓣和副冠中的表达都是随着花衰老过程呈现逐渐下降的趋势,且NtACS1基因在花瓣和副冠中的表达峰值都在花苞期,表明NtACS1基因编码的蛋白是在乙烯生物合成途径的系统1发挥催化作用的ACC合成酶。成功构建了 NtACS1基因的正义植物表达载体,并通过农杆菌介导法获得转基因烟草,经PCR和RT-PCR检测,其中有6株为阳性植株。初步证实了NtACS 基因已导入烟草基因组中且在烟草中已表达。2.以’云香’水仙花瓣为试验材料,采用RT-PCR技术克隆出乙烯生物合成途径中的关键酶ACC氧化酶(ACO)基因的全长序列1 162bp,命名为NtAC01(GenBank登录号为KX082935)。其开放阅读框(ORF)长度为939 bp,编码312个氨基酸。NtACO1蛋白包括ACO家族保守的DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy结构域。分子进化树分析表明,NtACO1蛋白与’金盏银台’水仙亲缘关系最近。通过qRT-PCR检测NtACO1在’云香’水仙花朵开放过程中的表达模式,结果表明,NtACO1在花瓣和副冠中的表达量随着花朵发育衰老而逐渐上升,并且各个时期花瓣中的表达量都高于副冠,推测NtACO1可能参与了’云香’花的发育和衰老。构建了NtACO 的正、反义植物表达载体,并以烟草叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系,获得NtACO1过表达转基因植株。转基因烟草与野生型相比缩短了营养生长期,开花较早,叶片较少。3.利用RT-PCR技术,从’云香’水仙中克隆出1个新的ACO(ACC氧化酶)基因NtACOY2(GenBank登录号为KX214535)。NtACOY2基因全长975bp,开放阅读框(ORF)936bp,编码311个氨基酸残基,蛋白分子量为35.83 kD。蛋白结构预测发现,该蛋白含有典型的ACO家族保守的DIOX_N和20G-Fe Ⅱ_Oxy结构域。进化分析表明,NtACOY2编码的氨基酸序列高度保守。实时荧光定量PCR表明,NtACOY2在花瓣和副冠中的表达均随着’云香’水仙花的衰老而逐渐上升,并且各个时期花瓣中的表达量均高于副冠,在花蕾期的花瓣中表达量达到最高,表明NtACOY2基因可能参与’云香’水仙花的发育,并且与其花衰老密切相关。通过PCR和酶切反应鉴定,成功构建了NtACOY2基因的植物表达载体,经农杆菌介导进行遗传转化,PCR检测显示共有15株转化植株扩增出了与阳性对照大小相同的片段,进一步用RT-PCR鉴定阳性转化植株,最终获得了 12株转基因烟草。扩增出了 1条约为975bp NtACOY2片段,而野生型无此条带;随机选取2株转基因植株(Z1、Z2)与野生型(WT)完全相同条件下移栽温室培养,结果Z1、Z2分别比WT提前8d和7d开花,且转基因烟草花朵开放数量均多于野生型,表明NtACOY2在转录水平能够正常表达。