目的:我们实验室前期采用膜蛋白质组学技术,研究口腔鳞癌肿瘤干细胞表面特征性膜蛋白分子标志物时,发现多种粘附相关分子在肿瘤干细胞中表达异常,其中活化白细胞粘附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)、又名CD166,其表达水平与肿瘤干细胞的生物学行为密切相关。CD166可以作为细胞膜表面标志物来富集口腔鳞癌干细胞,它还参与了对肿瘤干细胞干性的维持。高表达CD166的鳞癌患者往往易复发、预后差,提示CD166是一个潜在的肿瘤干细胞靶向治疗靶点。本项目旨在前期研究工作的基础上,深入研究CD166调控口腔鳞癌干细胞干性的具体作用,初步阐明CD166与EGFR信号通路之间的关系。方法:选取口腔鳞癌患者40例,各取癌组织及癌旁正常组织。实时定量PCR检测组织样本中CD166的mRNA水平;随机选取口腔鳞癌标本20例,蛋白印迹技术检测蛋白表达水平。用微球培养技术,检测微球中CD166的mRNA水平及蛋白水平。在口腔鳞癌细胞系中检测CD166敲除和过表达情况下,应用生长曲线,侵袭实验,平板克隆,微球培养等细胞生物学技术,检测、分析CD166对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、克隆形成等生物学行为的影响;并通过激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化;应用裸鼠移植瘤技术,检测CD166对裸鼠体内成瘤能力的影响。通过激光共聚焦显微镜,检测EGFR和CD166共定位情况。通过co-IP检测EGFR和CD166相互作用。通过免疫组化检测CD166与pEGFR(1068)在口腔鳞癌临床样本中的表达水平。通过CD166抑制和过表达技术,观察CD166对EGFR信号通路的调控及其对下游信号分子的影响。结果:CD166的转录和翻译水平在口腔鳞癌细胞系及组织样本中表达显著上调,明显高于对照组(P=0.001)。在口腔鳞癌细胞微球中,CD166的mRNA和蛋白水平比贴壁培养的细胞显著增加。在口腔鳞癌细胞系中过表达CD166,能明显提高细胞克隆形成能力、侵袭能力和微球形成能力;抑制CD166,结果正好相反。免疫组化染色结果显示,CD166阳性率和pEGFR为正相关关系(r=0.373,P<0.001)。激光共聚显微镜焦蛋白定位显示,CD166与EGFR在口腔鳞癌细胞的细胞膜上存在明确的共定位。Co-IP检测结果发现,CD166与EGFR形成蛋白复合体。在口腔鳞癌细胞系细胞中过表达CD166、EGF刺激下,可以明显提高pEGFR(1068、1045)、pFAK、pERK、pAKT蛋白的表达水平,并提高pEGFR稳定性,减少pEGFR泛素化降解。相反,抑制CD166,可以明显降低pEGFR(1068、1045)、pFAK、pERK、pAKT表达水平,降低pEGFR稳定性,增加了pEGFR泛素化降解。通过激光共聚焦显微镜检测也发现,在EGF刺激下,口腔鳞癌细胞过表达CD166后,可以提高pEGFR的稳定性;反之,抑制CD166,可以加快pEGFR降解;同时观察到细胞骨架排列的变化。通过与表皮生长因子受体相互作用,CD166可以通过降低CBL介导的pEGFR的泛素化和随后溶酶体降解,由此有助于稳定EGFR的活性。拉帕替尼能有效抑制EGF/EGFR信号通路的激活和EGFR和FAK的磷酸化活性;而PF562271可有效抑制FAK磷酸化,上述2个抑制剂都对CD166表达水平无影响。拉帕替尼和PF-562271能显著阻断由CD166过表达诱导的口腔鳞癌细胞克隆形成和侵袭能力;同时可以阻断细胞骨架的变化。抑制CD166可以明显抑制口腔鳞癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。结论:CD166与EGFR相互作用后,可以提高EGFR磷酸化活性形式的稳定性,并维持EGF/EGFR信号的组合性激活;并进一步促进FAK的磷酸化,导致细胞骨架蛋白的重组、细胞克隆形成和侵袭能力的提高。而抑制CD166表达,可以促进EGFR的泛素化降解,加快EGF/EGFR信号通路的失活。提示CD166可以作为口腔鳞癌靶向治疗的有效分子靶标。