【摘 要】
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利用三维荧光检测肌氨酸氧化酶(SOX)内源荧光物质的特征峰,探究SOX热失活机理以及在粗酶液中快速检测活性蛋白的应用.采集色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和SOX三维荧光光谱数据,确定SOX中Trp、Tyr和FAD内源荧光峰位置.考察不同温度(30℃～90℃)热处理15 min后SOX内源荧光峰位置和强度变化,建立FAD荧光强度与SOX活性蛋白浓度之间的线性关系模型,在重组菌粗酶液中验证方法可行性.结果表明:SOX中主要存在氨基酸残基和FAD两种内源荧光特征峰.光电信增管(
【机 构】
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江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122
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利用三维荧光检测肌氨酸氧化酶(SOX)内源荧光物质的特征峰,探究SOX热失活机理以及在粗酶液中快速检测活性蛋白的应用.采集色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和SOX三维荧光光谱数据,确定SOX中Trp、Tyr和FAD内源荧光峰位置.考察不同温度(30℃～90℃)热处理15 min后SOX内源荧光峰位置和强度变化,建立FAD荧光强度与SOX活性蛋白浓度之间的线性关系模型,在重组菌粗酶液中验证方法可行性.结果表明:SOX中主要存在氨基酸残基和FAD两种内源荧光特征峰.光电信增管(PMT)电压400 V下检测氨基酸荧光峰,在热处理过程中,随着温度升高,氨基酸荧光峰波长范围基本不变,荧光强度从592.75 a.u.增加到1104 a.u..PMT电压700 V下检测FAD荧光峰,30℃～55℃热处理后SOX样品中FAD荧光峰波长范围不变,荧光强度从890.16 a.u.下降到804.21 a.u.;60℃～90℃时,FAD荧光峰变为游离态FAD特征峰,荧光强度从115.72 a.u.增加到142.13 a.u.,高温使FAD由结合态转为游离态,导致酶蛋白基本失活.根据SOX中FAD特异性荧光峰和荧光强度可预测粗酶液中SOX活性蛋白浓度.室温下,FAD荧光强度与SOX活性蛋白质量浓度在0.05～1.0 mg/mL范围内线性关系良好,拟合曲线R2=0.9929.经验证,曲线预测均方根误差(RMSEP)为0.0978,平均浓度回收率为99.7％.通过检测SOX特异性的内源FAD三维荧光,不仅能解析SOX的热失活机理,还能根据FAD荧光强度快速测量粗酶液中SOX蛋白浓度,为其他以FAD为辅酶的黄素类蛋白快速检测分析提供借鉴.
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