【摘 要】
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建立一种尿酸酶突变体的高通量筛选方法。将野生型苛求芽孢杆菌尿酸酶及其突变体的表达载体转入大肠杆菌,每个克隆诱导培养后超声裂解上清液为样品,全自动酶标仪测定293 nm光
【机 构】
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重庆医科大学附属永川医院中心实验室,重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(30672009);教育部新世纪优秀人才支持计划基金资助项目(NCET-09-0928);重庆市科委重点基金资助项目(CSTC2011BA5039)
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建立一种尿酸酶突变体的高通量筛选方法。将野生型苛求芽孢杆菌尿酸酶及其突变体的表达载体转入大肠杆菌,每个克隆诱导培养后超声裂解上清液为样品,全自动酶标仪测定293 nm光吸收,并分析反应启动后8~28 min的数据计算酶活性,Bradford法测定总蛋白;ROC比较用酶活性或比活性识别阳性突变体的可靠性。任2种突变体酶活性或比活性比值>2时,ROC分析曲线下面积接近1;当酶活性或比活性仅增加50%时,分析比活性所得曲线下面积比分析酶活性更大,将ROC分析比活性提高近1倍。突变体敏感度达90%时,比活性为判断阳性突变体阈值,其相当于以起始物比活性均值加1.7倍标准差;此阈值能用于高通量筛选变体库中比活性增加1倍以上的阳性突变体。
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