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摘要：目的： 探讨IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤的中的诊断价值。方法 ：用PCR凝胶电泳检测B细胞非霍奇金淋巴瘤中IgH基因克隆性重排。结果：43例B细胞非霍奇金淋巴瘤中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率55.2%； FR3A或者FR2A引物联合检测的总阳性率为90.7%。结论：PCR凝胶电泳技术检测IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有重要的辅助价值。
关键词：B细胞 非霍奇金淋巴瘤 IgH基因 克隆重排
基金项目：国家自然科学基金项目（30770918）；教育部留学回国人员科研启动基金（2008-890）；浙江省科技厅科学研究基金（2009C33039）；浙江省大学生科技创新项目（2009-294）
淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后 [1-2]。 淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型， 但无法解决良恶性鉴别难题。近年来， 国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
胚系状态下，IgH基因由可变区 （V） 、多变区 （D） 、连接区 （J ） 、恒定区 （C） 构成。这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（ IgH ） 基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。因此，这种单克隆 IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。
1. 材料与方法
1.1. 标本来源 收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记证实，以确定所取标本确为病变组织。阳性对照为Raji细胞。阴性对照为不加任何DNA模板的反应体系。
1.2. IgH基因重排分析
1.2.1. 模板DNA的提取：石蜡标本，，酚氯仿法或QIAGEN专用试剂盒法抽提DNA。紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度。-20℃保存备用。
1.2.2. 石蜡组织标本DNA检测：采用引物KM29-KM38和RS42-KM29对所抽提的淋巴瘤组织DNA进行扩增（引物序列见表1），测定人类基因组中保守序列β-globin，在268bp及536bp处见一清晰亮带者为合格样品，取其进行后续试验。
1.2.3. 半巢式PCR检测重排：所用引物序列见表1。（1）梯度稀释模板DNA，在96孔PCR仪（MWG Biotech，德国）中进行扩增。第一轮引物用FR3A（FR2A）和LJH，扩增产物经1：100稀释后，取2？l作为模板进行第二轮扩增，引物改用FR3A（FR2A）和VLJH。取上述PCR产物10？l进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，应用紫外灯观察结果并用凝胶成像分析系统进行记录及分析。（2）PCR阳性判断标准：FR3A：三个浓度的模板中至少有两个浓度在70-130bp范围内见一条或两条处于同一位置的致密亮带；FR2A：三个浓度的模板中至少有两个浓度在180-260bp范围内见一条或两条处于同一位置的致密亮带。
表1 PCR引物序列
2. 结果
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果：43例B-NHL中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率51.2%；39例用FR3A或者FR2A引物检测阳性，阳性率90.7%。
图1：IgH重排检测结果。图A、图B分别为FR3A、FR2A 1.5%琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker，NC为阴性对照，PC为阳性对照，1～3为病例1，4～6为病例2，7～9为病例3 。
3. 讨论
在正常人和反应性淋巴组织增生等疾病中， 因为淋巴细胞起源于多克隆， 基因重排形式多种多样，PCR产物片段长短不一，序列不同，电泳后见到多克隆性重排条带，而B细胞非霍奇金淋巴瘤绝大多数都是单克隆起源的， 电泳后见单一的克隆重排条带， 所以可以运用 PCR技术检测IgH基因重排用于B-NHL的辅助诊断。
2003年欧洲七国47个研究所的病理学家、分子生物学家及其它研究人员经过四年半的研究发表了标准化引物系统（BIOMED-2），建立了用于克隆性分析的基因重排及染色体易位检测的PCR方法学和引物设计的标准化，可以将阳性率提高到95%以上[3-4]。但因其引物的复杂性，会大大增加检测的时间和工作量，在国内的普遍推广使用还有一定距离。我们研究中所采用的IgH通用性引物行半巢式PCR由于其引物简单，敏感性也较好目前仍在国内外应用。
以往的大量研究都存在这样一个问题，石蜡包埋组织的克隆重排检出率比较低。在本研究中，我们前期使用常规酚氯仿法抽提DNA，后期全部使用德国QIAGEN专用试剂盒抽提DNA，发现重排阳性检出率明显提高（FR3A检出率由88.2%提高到90%；FR2A检出率由38.2%提高到54.3%）。同时我们也注意到，标本固定、存档时间越短，重排检测越容易。
综上所述，IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有着重要的辅助价值。淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难题，在HE切片及免疫组化的基础上，再结合基因克隆重排等分子病理学诊断，能够大大提高淋巴瘤的诊断水平，减少误诊漏诊率。而关于IgH基因重排的分子特征以及淋巴瘤的其他一些重要分子机制，还有待于我们不断地研究和探讨。
参考文献：
1. Dave SS， Fu K， Wright GW， et al. Molecular diagnosis of Burkitt's lymphoma. N Engl J Med. 2006，354（23）：2431-2442.
2. Ngo VN， Davis RE， Lamy L， et al. A loss-of-function RNA interference screen for molecular targets in cancer. Nature. 2006 ，441（7089）：106-107.
3. PAS Evans， Ch Pott， PJTA Groenen， et al. Signi？cantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies By Use of Multiple immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia，2007（21）：207–214.
4. 张婧 吴迎辉 孔海鹰，等. BIOMED-2聚合酶链反应Ig基因重排对成熟非霍奇金B细胞淋巴瘤诊断的价值.中华病理学杂志，2009，38（11）：739-744.
关键词：B细胞 非霍奇金淋巴瘤 IgH基因 克隆重排
基金项目：国家自然科学基金项目（30770918）；教育部留学回国人员科研启动基金（2008-890）；浙江省科技厅科学研究基金（2009C33039）；浙江省大学生科技创新项目（2009-294）
淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后 [1-2]。 淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型， 但无法解决良恶性鉴别难题。近年来， 国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
胚系状态下，IgH基因由可变区 （V） 、多变区 （D） 、连接区 （J ） 、恒定区 （C） 构成。这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（ IgH ） 基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。因此，这种单克隆 IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。
1. 材料与方法
1.1. 标本来源 收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记证实，以确定所取标本确为病变组织。阳性对照为Raji细胞。阴性对照为不加任何DNA模板的反应体系。
1.2. IgH基因重排分析
1.2.1. 模板DNA的提取：石蜡标本，，酚氯仿法或QIAGEN专用试剂盒法抽提DNA。紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度。-20℃保存备用。
1.2.2. 石蜡组织标本DNA检测：采用引物KM29-KM38和RS42-KM29对所抽提的淋巴瘤组织DNA进行扩增（引物序列见表1），测定人类基因组中保守序列β-globin，在268bp及536bp处见一清晰亮带者为合格样品，取其进行后续试验。
1.2.3. 半巢式PCR检测重排：所用引物序列见表1。（1）梯度稀释模板DNA，在96孔PCR仪（MWG Biotech，德国）中进行扩增。第一轮引物用FR3A（FR2A）和LJH，扩增产物经1：100稀释后，取2？l作为模板进行第二轮扩增，引物改用FR3A（FR2A）和VLJH。取上述PCR产物10？l进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，应用紫外灯观察结果并用凝胶成像分析系统进行记录及分析。（2）PCR阳性判断标准：FR3A：三个浓度的模板中至少有两个浓度在70-130bp范围内见一条或两条处于同一位置的致密亮带；FR2A：三个浓度的模板中至少有两个浓度在180-260bp范围内见一条或两条处于同一位置的致密亮带。
表1 PCR引物序列
2. 结果
PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果：43例B-NHL中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率51.2%；39例用FR3A或者FR2A引物检测阳性，阳性率90.7%。
图1：IgH重排检测结果。图A、图B分别为FR3A、FR2A 1.5%琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker，NC为阴性对照，PC为阳性对照，1～3为病例1，4～6为病例2，7～9为病例3 。
3. 讨论
在正常人和反应性淋巴组织增生等疾病中， 因为淋巴细胞起源于多克隆， 基因重排形式多种多样，PCR产物片段长短不一，序列不同，电泳后见到多克隆性重排条带，而B细胞非霍奇金淋巴瘤绝大多数都是单克隆起源的， 电泳后见单一的克隆重排条带， 所以可以运用 PCR技术检测IgH基因重排用于B-NHL的辅助诊断。
2003年欧洲七国47个研究所的病理学家、分子生物学家及其它研究人员经过四年半的研究发表了标准化引物系统（BIOMED-2），建立了用于克隆性分析的基因重排及染色体易位检测的PCR方法学和引物设计的标准化，可以将阳性率提高到95%以上[3-4]。但因其引物的复杂性，会大大增加检测的时间和工作量，在国内的普遍推广使用还有一定距离。我们研究中所采用的IgH通用性引物行半巢式PCR由于其引物简单，敏感性也较好目前仍在国内外应用。
以往的大量研究都存在这样一个问题，石蜡包埋组织的克隆重排检出率比较低。在本研究中，我们前期使用常规酚氯仿法抽提DNA，后期全部使用德国QIAGEN专用试剂盒抽提DNA，发现重排阳性检出率明显提高（FR3A检出率由88.2%提高到90%；FR2A检出率由38.2%提高到54.3%）。同时我们也注意到，标本固定、存档时间越短，重排检测越容易。
综上所述，IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有着重要的辅助价值。淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难题，在HE切片及免疫组化的基础上，再结合基因克隆重排等分子病理学诊断，能够大大提高淋巴瘤的诊断水平，减少误诊漏诊率。而关于IgH基因重排的分子特征以及淋巴瘤的其他一些重要分子机制，还有待于我们不断地研究和探讨。
参考文献：
1. Dave SS， Fu K， Wright GW， et al. Molecular diagnosis of Burkitt's lymphoma. N Engl J Med. 2006，354（23）：2431-2442.
2. Ngo VN， Davis RE， Lamy L， et al. A loss-of-function RNA interference screen for molecular targets in cancer. Nature. 2006 ，441（7089）：106-107.
3. PAS Evans， Ch Pott， PJTA Groenen， et al. Signi？cantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies By Use of Multiple immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia，2007（21）：207–214.
4. 张婧 吴迎辉 孔海鹰，等. BIOMED-2聚合酶链反应Ig基因重排对成熟非霍奇金B细胞淋巴瘤诊断的价值.中华病理学杂志，2009，38（11）：739-744.