榛属植物多酚提取方法的研究

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  摘要植物多酚具有极强的抗氧化、抑菌、抗炎、防辐射、降血压等生理活性。为有效开发利用东北野生榛属资源,以东北野生平榛、毛榛为试验材料,以榛叶为提取对象,采用溶剂萃取法超声波辅助处理的提取方法,对2种榛属多酚进行提取分离,以确定榛属多酚提取分离最优方法。通过单因素试验及正交试验获得的最佳提取条件为:80%乙醇作为提取剂,料液比为1∶14 g/ml,75 ℃,浸提3 h,浸提2次,超声波辅助40 min。在此条件下榛叶总多酚得率为2.565 6%。取材上,平榛与毛榛间差异不显著,但取材时间上差异显著,8月取材总多酚得率最高。
  关键词榛属植物;多酚;提取方法
  中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(2015)21-282-04
  我国东北榛属植物以平榛、毛榛为主[1],分布广泛,资源丰富,但大多处于野生状态,且这类榛树存在果实小、果壳厚、出仁率低等缺点,未对其进行良好的加工和利用,附加值相当低[2-4]。植物多酚具有极强的抗氧化、酶活性抑制、抑菌、抗致突变、抗炎、防辐射、降血压、抗癌等活性[5-7]。目前国内还未对榛子中的多酚进行开发利用,因此,从资源丰富的东北野生榛属植物中提取多酚物质并开发利用具有重要的意义。
  多酚提取的报道多集中在茶叶、水果等植物中[8-12],对于从榛叶中提取报道较少[13-15],因此对榛叶多酚提取的方法进行研究,对于有效开发利用东北野生榛属植物具有重要意义。溶剂萃取法是多酚提取常用的方法,超声波法已经在多种有机成分提取中被广泛应用[16-17],将其作为辅助手段应用于榛叶多酚的溶剂萃取工艺中,有利于提高提取效果,获得可进行工业化生产的提取工艺。
  笔者以东北野生平榛、毛榛为试验材料,以榛叶为提取对象,采用溶剂萃取法加以超声波辅助的提取方法,对2种榛属多酚进行提取分离,确定榛属多酚提取分离最优方法,为有效开发利用东北野生榛属资源提供技术方法。
  1材料与方法
  1.1材料
  以采自佳木斯大学榛子种植圃的东北平榛和毛榛为试验材料,分别于6、7、8月进行榛叶的采集。将叶片干燥,粉碎,备用。
  1.2方法
  1.2.1榛叶多酚提取方法。
  采集榛子叶→将榛叶置于密封袋内利用硅胶粒吸干→粉碎→ 浸提→过滤→获得榛叶多酚粗提液,将粗提液定容,利用比色法来测定吸光度,然后计算榛叶多酚得率。再然后进行旋轉蒸发→在60 ℃下烘干→获得总多酚干样。
  1.2.2标准曲线的确定。
  称取干没食子酸 0.5 g,溶解于水中并定容至100 ml,获得0.5% 母液。分别取没食子酸母液0、0.5、1.0、1.5、2.5 ml,置于 50 ml容量瓶中稀释。再分别吸取上述稀释后溶液 0.5 ml,各加水 20 ml,福林-肖卡试剂5 ml,混合均匀,各加入20% 碳酸钠溶液15 ml,混和均匀后定容至 50 ml。将上述溶液于 20 ℃下静置2 h,然后测定756 nm波长下的吸光度[18]。绘制标准曲线并进行回归处理,得回归标准曲线方程为:y=4.984 6x+0.066 4(其中,x为没食子酸标准溶液,mg/ml;y为波长760 nm 处测定吸光度值),R2=0.980 4。
  1.2.3榛叶总多酚含量的测定方法。
  将榛叶干燥、粉碎,称取1.5 g,使用溶剂浸提法处理后,过滤提取液,并收集榛叶多酚粗提液,向上述粗提液0.5 ml中加入20 ml水,5 ml福林-酚试剂,混合均匀,然后迅速(30~480 s)加入20% 碳酸钠溶液15 ml,混合均匀,然后用水定容至50 ml。将上述溶液在温度为 20 ℃的条件下,静置 2 h,测定765 nm 波长下的吸光度,然后代入回归方程,求榛叶多酚粗提液中总多酚类物质的含量,同时做 2 次平行试验。按照下列公式计算总多酚得率:
  总多酚得率% =C×50×V1m×V2 ×106× 100
  式中,C为总多酚质量浓度(mg/ml);50为提取液定容体积(ml);V1为按一定料液比所得体积(ml);V2为吸取提取液体积 (ml) ;m为原料质量(g)[18]。
  1.2.4榛叶总多酚提取最佳溶剂的确定。
  以乙醇、甲醇、丙酮3种溶剂做提取剂,体积分数分别设定为40%、50%、60%、70%、80%,提取温度为60 ℃,设定料液比为1∶10 g/ml,提取时间为2 h,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,确定适宜的提取溶剂。
  1.2.5溶剂萃取法工艺优化。
  称取榛叶粉末1.5 g(准确至0.000 1 g),放入150 ml锥形瓶中,研究料液比、浸提温度、时间、次数及超声波辅助对榛叶总多酚含量的影响进行单因素试验,并在此基础上进行正交试验。
  1.2.5.1料液比对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  称取15 g(准确至0.000 1 g)榛叶粉末样品,提取条件为70%乙醇溶液作为提取溶剂,提取温度为60 ℃,提取时间为2 h,料液比设置1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/ml 5个处理,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。
  1.2.5.2浸提温度对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  称取1.5 g(准确至0.000 1 g)榛叶粉末样品,提取条件为70%乙醇溶液作为提取溶剂,料液比为1∶10 g/ml,提取时间2 h,提取温度设置40、50、60、70、80 ℃ 5个处理,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。
  1.2.5.3浸提时间对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  称取1.5 g(准确至0.000 1 g)榛叶粉末样品,提取条件为70%乙醇溶液作为提取溶剂,料液比 1∶10 g/ml,提取温度为60 ℃,提取时间设1、2和3 h 3个处理,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。   安徽农业科学2015年
  1.2.5.4浸提次数对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  称取1.5 g(准确至0.000 1 g)榛叶粉末样品,提取条件为70%乙醇溶液作为提取溶剂,提取温度60 ℃,料液比1∶10 g/ml,提取时间1 h的提取条件,分别对样本进行1、2、3次提取 3个处理,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。
  1.2.5.5超声波处理时间对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  榛叶粉末样品1.5 g(准确至0.000 1 g),提取条件根据上述单因素试验最佳条件进行,超声波处理时间分别设置20、30、40、50 min 4个处理,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。
  1.2.6不同采集时期对榛属叶片多酚提取的影响研究。
  在温度为75 ℃,料液比1∶14 g/ml,乙醇浓度80%,提取时间为2 h的条件,分别对6、7、8月份采集的平榛、毛榛叶片进行榛叶总多酚提取,3次重复。提取方法与总多酚含量测定方法如前所述,并计算出粗提液中总多酚得率。
  2结果与分析
  2.1榛叶多酚提取的单因素试验研究
  2.1.1榛叶中总多酚最佳提取剂的确定。
  甲醇、乙醇、丙酮作为提取剂,设置5个提取分数进行多酚提取,计算总多酚得率,结果见图1。
  图1结果显示,40%丙酮总多酚得率最高,其次是80%甲醇,再次为70%乙醇,其总多酚得率分别为1.805%、1603%和1.438%,最佳提取剂为40%丙酮。但考虑工业化生产的成本和安全性,该研究选用了价格低廉、安全性高的70%乙醇作为提取剂。
  2.1.2料液比对榛叶总多酚提取效果的影响。
  设置了6种料液比处理,对不同料液比对榛叶总多酚提取效果的影响进行了分析,结果见图2。
  图2结果显示,料液比在1∶15 g/ml时总多酚得率最高为2.032 1%,随着料液比中溶剂的增加总多酚得率增加,料液比1∶15 g/ml时达到最大值,之后随着料液比中溶剂的增加总多酚得率下降,故最佳提取料液比为1∶15 g/ml。
  2.1.3浸提温度对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  在浸提温度分别为40、50、60、70和80 ℃时,分析了浸提温度对榛叶总多酚得率的影响,结果见图3。
  图3显示,随着浸提温度的升高,总多酚得率呈上升趋势,浸提温度80 ℃时总多酚得率为最高值(1.686 4%),所以最佳浸提温度为80 ℃。
  2.1.4浸提时间对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  设置3个浸提时间处理,计算榛叶总多酚得率,结果见图4。
  由图4可知,随着浸提时间的延长,总多酚得率不断增加,浸提3 h时获得总多酚得率最高,为1.377 4%。
  2.1.5浸提次数对榛叶中总多酚提取效果的影响。
  对试验材料进行1、2、3次浸提萃取,计算其总多酚得率,结果见图5。
  图5显示,随着浸提次数的增加,总多酚得率不断下降,第1次浸提总多酚得率为1.329 9%,第2次浸提总多酚得率为1.235 7%,第3次浸提总多酚得率为0.850 5%,考虑成本与环境污染,建议浸提萃取2次,总多酚得率为2.565 6%。
  2.1.6超声波辅助提取对提取效果的影响。
  提取条件根据上述试验选择单因素试验中最佳条件进行提取,为70%乙醇溶液作为提取溶剂,料液比1∶20 g/ml,提取温度80 ℃,提取时间3 h,超声波处理时间分别设置20、30、40、50 min 4个处理,3次重复,试验结果见图6。
  由图6可知,随着超声波辅助提取时间的增加,总多酚得率不断增加,当处理时间为40 min时,总多酚得率最高,之后随着处理时间的延长,总多酚得率不断下降,故选40 min的超声波辅助提取为该试验的最佳辅助处理时间。
  2.2榛子多酚提取的正交试验研究
  选定提取温度、提取溶剂体积分数及料液比作为溶剂提取法中的主要因素进行 L9(33)正交试验[19],其中正交试验因素水平设计见表1,结果见表2。以确定该方法的最佳因素组合。提取材料为榛属(平榛、毛榛)叶片
  由表2可知,各因子对提取效果影响大小顺序为(极差R的大小顺序)提取温度、料液比、溶剂体积分数;最佳提取因素组合为(按因素顺序每一因素K值最大的为最佳值)A1C1B3即提取温度75 ℃,料液比为1∶14 g/ml,溶剂体积分数为80%乙醇。
  2.3不同采集时期对榛属叶片多酚提取的影响
  分别对6、7、8月份的平榛、毛榛叶片进行多酚提取,以确定不同采集时期及不同种属间榛叶多总多酚提取的影响,结果见图7。
  图7显示,6月和7月取材的榛叶所获总多酚得率差别不大,8月取材的毛榛比平榛的总多酚得率稍高。对平榛和毛榛材料,在不同取材时间的总多酚得率进行了双因素方差分析,
  结果显示,榛属间F为4.430<4.747(F0.05),表明毛榛与平榛直接差异不显著,月份间F为6.827>3.885 7(F0.05),表明取材月份间差异显著,榛属与月份间的交互作用差异不显著,F为2.404>3.885(F0.05)。
  3讨论
  3.1最佳提取剂的选取
  虽然该研究中40%丙酮做提取剂时的总多酚得率最高,但是,该试验的目的是研究多酚提取的最佳方法并应用于大规模生产,由于丙酮有毒,既对人体健康不利,且对环境危害甚大,所以丙酮不适合作为最佳提取剂。甲醇和乙醇相比较下,乙醇比甲醇成本更低,且来源更廣泛。所以,在生产中选用乙醇做提取剂更切合实际,以应用于工业化成产。乙醇在不同植物的多酚提取中是常用的提取剂[20-22],田志琴在小米多酚活性物质的提取中将乙醇作为提取剂[23],与该研究的提取剂选择相同。   3.2榛叶多酚提取工艺的确定及改进
  鉴于多酚物质的抗癌、抗氧化、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能,研究者们进行了大量的从多种植物中提取多酚的工艺和提取方法的研究[8-12],但进行榛叶多酚提取方法和工艺优化的研究鲜有报道。该研究将提取方法确定为溶剂萃取法辅助超声波处理,提取流程为榛叶→烘干→粉碎→ 浸提→超声波处理→过滤→得到榛叶提取液→旋转蒸发→烘干(60 ℃)→总多酚干样获得。经过2次浸提萃取,总多酚得率为2.565 6%,该研究所得粗提物并不能直接应用,应进行提取方法的进一步优化和探索并进行纯化以
  满足科研和商品化生产的要求。
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