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【摘 要】本文对药品无菌检测中培养基灭菌控温验证方法进行研究。
【关键词】药品；无菌；验证
无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-5]。无菌检查全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等[6-10]。本文对药品无菌检测中培养基灭菌控温验证方法进行研究。
1.验证目的
本次验证主要进行的运行、性能确认，以确认本设备能够达到工艺技术要求并满足GMP要求。
2.验证范围
适用于化验室立式压力蒸汽灭菌柜的验证。
3.验证相关文件及资料
（1）相关文件及资料：药品生产质量管理规范（2010年修订）、立式压力蒸汽灭菌柜使用说明书。
（2）所需仪器、设备：EBRO无线温度检测仪。
（3）所需试剂：嗜热脂肪杆菌指示剂。
4.法规标准要求
（1）设备的设计与安装应符合药品生产及工艺的要求，安全、稳定、可靠，易于清洗、消毒或灭菌，便于生产操作和维修保养，并能防止差错和交叉污染。
（2）用于生产和检验的仪器、仪表、量具、衡器等其适用范围和精密度应符合生产和检验要求，有明显的合格标志，并定期校验。
（3）压力容器应具有法律部门认可的各项设计、制造、检测、使用等许可证和报告。
5.验证实施
5.1人员培训
（1）目的：使生产相关人员掌握相关操作规程及工艺规程。
（2）程序：对验证实施有关人员进行灭菌罐验证方案培训、灭菌罐操作规程培训。
（3）可接受标准：上岗操作人员已经接受了方案及操作规程培训，并经考核合格后方可上岗。
5.2运行确认（OQ）
5.2.1灭菌罐盖运行可控
（1）目的：检查并确认灭菌罐盖运行可控。
（2）程序：抬起灭菌罐盖，关闭灭菌罐盖，此过程重复三次。
（3）灭菌罐盖密封圈目测外观
（4）可接受标准：灭菌罐盖开合正常。灭菌罐盖密封圈目测外观无任何可清洁污渍与油渍，应无密封圈脱出密封槽、老化、破损现象。
5.2.2灭菌柜PLC手动程序测试
（1）目的：确认灭菌罐手动操作程序符合设备要求。
（2）程序：按照灭菌罐标准操作规程进入手动操作界面，将控制面板上的绿色数显温度设定为129℃，时间任意设定（不为零）。
（3）可接受标准：温度设定为130℃时安全阀跳起，微电脑控制停止。
5.3 性能确认（PQ）
5.3.1仪表性能确认
（1）目的：对仪表性能进行确认，确认其能够达到使用要求。
（2）程序：确认温度指示、传感器、温度记录仪的读数值：空载热分布测试时同时监测设备自身控制系统的温度显示示数和验证仪冷点温度探头显示示数，并记录3次。确认时间记录仪：当灭菌罐腔室内达到预置的灭菌温度时，用标准秒表计时，当灭菌罐的灭菌计时达到时停止标准秒表的计时，记录灭菌时间设定值和标准秒表计时值，连续记录3次。
（3）可接受标准：
温度探头符合要求；温度指示探头实际显示数值与设定温度之间的误差应≤±0.5℃；时间记录仪与标准时间指示装置之间的误差应≤±1%。
5.3.2热分布测试
（1）目的：检查并确认灭菌罐在预定的灭菌条件下，空载运行时灭菌罐内的温度均匀性，确认灭菌罐控制用传感器位于灭菌室内的冷点区；检查并确认灭菌罐在满载运行时，灭菌罐的温度均匀性。
（2）程序：
1）空载热分布实验：将12个温度探头均匀分布在腔室内的物架上且探头不与腔室内壁及其他金属接触，至少有一支探头位于设备自身控制系统的温度传感器附近。运行自动灭菌程序，确认内室温度为121℃时开始计时，每10秒钟采集一次各探头温度值，30分钟后结束，以证明热分布的均一性，确定最冷点及F0值，以上测试连续做三次。
2）负载热分布实验：将腔室内放入待灭菌的培养基，培养基放入1L三角烧瓶中，每瓶最多放1000ml培养基。腔室内最多放四瓶，最少放一瓶。其它方法与空载热分布相同，同样取得一组数据。实验4次。分别在放一瓶、两瓶、三瓶、四瓶情况下做负载热分布试验，确认最冷点及达到灭菌条件时间。
3）热分布探头分布图：
将1支探头与温度控制和记录的传感器（冷点）旁，其余探头均匀置于腔室各处，各探头的测温点不得与金属及其他表面接触。
4）分别对照空载热分布及负载热分布测定记录进行灭菌过程温度均匀性的分析，主要看灭菌腔室达到设定的灭菌温度并稳定后（一般3分钟后）至灭菌计时结束期间灭菌室的温度分布情况，在“高低差”栏中找出最大的5个数值并将最高、最低与平均值相比较，找出最大误差。
（3）可接受标准：
确认灭菌温度≥121℃，灭菌时间：30分钟，F0>15，各点的温度在每次灭菌程序运行过程中的差值≤1℃。
5.3.3热穿透试验和生物指示剂挑战性实验
（1）目的：确定装载中的“最冷点”，并肯定该点在灭菌过程中获得充分的无菌保证值。
（2）程序：将探头放入培养基内，分别按负载热分布装载方式进行热穿透试验。其他方法与满载热分布相同，各得出三组数据；生物指示剂挑战性实验随热穿透试验同步进行，将嗜热脂肪杆菌指示剂1支放到非冷点培养基烧瓶内，另一支放到冷点培养基烧瓶内，一起灭菌。
（3）可接受标准：满载状态下，确认灭菌温度121℃，灭菌时间：30分钟，F0≥15将指示剂放在恒温培养箱中培养7天，56-60℃，指示剂应呈紫色。另取一支未灭菌的指示剂，一同培养后，应呈黄色。
5.3.4灭菌效果验证
微生物挑战性试验合格后，按照灭菌程序连续灭三批培养基。其中每批包括营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁琼脂。灭菌后将上述培养基铺成菌碟后进行培养。可接受标准：菌碟应无菌生长。 [科]
【参考文献】
[1]乐正永.无菌检查方法验证资料分析[J].中国现代药物应用，2008（23）.
[2]刘玉军，徐占鳌，梁毅.药品无菌过滤验证的缺陷探析[J].中国药事，2010（06）.
[3]陈西勇，于淑渤，梁宏.无菌药品生产发生微生物污染的因素分析（下）[J].首都医药，2009（08）.
[4]郭绍雄，张祥凤，谢敬东.实施药品生产GMP管理的对策分析[J].中国当代医药，2010（02）5（01）.
[5]王新建，王凤山，王海燕.最终灭菌药品无菌保证体系和参（下转第328页）（上接第300页）数放行的关键因素探讨[J].齐鲁药事，2006（03）.
[6]宋勤，袁林娜.中国药典与欧州药典无菌检查培养基灵敏度的比较实验[J].药物分析杂志，2005（11）.
[7]许华玉，李智勇，王国荣.2005版《中国药典》无菌检查法修订内容的介绍[J].中国药品标准，2005（02）.
[8]徐林.GMP的无菌保证[J].中国医药工业杂志，2000（03）.
[9]赵宏大，谢文，纪绍梅.我国微生物培养基用琼脂的标准研究[J].中国药事，2010（06）.
[10]陈西勇，于淑渤，梁宏.无菌药品生产发生微生物污染的因素分析（上）[J].首都医药，2009（06）.
【关键词】药品；无菌；验证
无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-5]。无菌检查全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等[6-10]。本文对药品无菌检测中培养基灭菌控温验证方法进行研究。
1.验证目的
本次验证主要进行的运行、性能确认，以确认本设备能够达到工艺技术要求并满足GMP要求。
2.验证范围
适用于化验室立式压力蒸汽灭菌柜的验证。
3.验证相关文件及资料
（1）相关文件及资料：药品生产质量管理规范（2010年修订）、立式压力蒸汽灭菌柜使用说明书。
（2）所需仪器、设备：EBRO无线温度检测仪。
（3）所需试剂：嗜热脂肪杆菌指示剂。
4.法规标准要求
（1）设备的设计与安装应符合药品生产及工艺的要求，安全、稳定、可靠，易于清洗、消毒或灭菌，便于生产操作和维修保养，并能防止差错和交叉污染。
（2）用于生产和检验的仪器、仪表、量具、衡器等其适用范围和精密度应符合生产和检验要求，有明显的合格标志，并定期校验。
（3）压力容器应具有法律部门认可的各项设计、制造、检测、使用等许可证和报告。
5.验证实施
5.1人员培训
（1）目的：使生产相关人员掌握相关操作规程及工艺规程。
（2）程序：对验证实施有关人员进行灭菌罐验证方案培训、灭菌罐操作规程培训。
（3）可接受标准：上岗操作人员已经接受了方案及操作规程培训，并经考核合格后方可上岗。
5.2运行确认（OQ）
5.2.1灭菌罐盖运行可控
（1）目的：检查并确认灭菌罐盖运行可控。
（2）程序：抬起灭菌罐盖，关闭灭菌罐盖，此过程重复三次。
（3）灭菌罐盖密封圈目测外观
（4）可接受标准：灭菌罐盖开合正常。灭菌罐盖密封圈目测外观无任何可清洁污渍与油渍，应无密封圈脱出密封槽、老化、破损现象。
5.2.2灭菌柜PLC手动程序测试
（1）目的：确认灭菌罐手动操作程序符合设备要求。
（2）程序：按照灭菌罐标准操作规程进入手动操作界面，将控制面板上的绿色数显温度设定为129℃，时间任意设定（不为零）。
（3）可接受标准：温度设定为130℃时安全阀跳起，微电脑控制停止。
5.3 性能确认（PQ）
5.3.1仪表性能确认
（1）目的：对仪表性能进行确认，确认其能够达到使用要求。
（2）程序：确认温度指示、传感器、温度记录仪的读数值：空载热分布测试时同时监测设备自身控制系统的温度显示示数和验证仪冷点温度探头显示示数，并记录3次。确认时间记录仪：当灭菌罐腔室内达到预置的灭菌温度时，用标准秒表计时，当灭菌罐的灭菌计时达到时停止标准秒表的计时，记录灭菌时间设定值和标准秒表计时值，连续记录3次。
（3）可接受标准：
温度探头符合要求；温度指示探头实际显示数值与设定温度之间的误差应≤±0.5℃；时间记录仪与标准时间指示装置之间的误差应≤±1%。
5.3.2热分布测试
（1）目的：检查并确认灭菌罐在预定的灭菌条件下，空载运行时灭菌罐内的温度均匀性，确认灭菌罐控制用传感器位于灭菌室内的冷点区；检查并确认灭菌罐在满载运行时，灭菌罐的温度均匀性。
（2）程序：
1）空载热分布实验：将12个温度探头均匀分布在腔室内的物架上且探头不与腔室内壁及其他金属接触，至少有一支探头位于设备自身控制系统的温度传感器附近。运行自动灭菌程序，确认内室温度为121℃时开始计时，每10秒钟采集一次各探头温度值，30分钟后结束，以证明热分布的均一性，确定最冷点及F0值，以上测试连续做三次。
2）负载热分布实验：将腔室内放入待灭菌的培养基，培养基放入1L三角烧瓶中，每瓶最多放1000ml培养基。腔室内最多放四瓶，最少放一瓶。其它方法与空载热分布相同，同样取得一组数据。实验4次。分别在放一瓶、两瓶、三瓶、四瓶情况下做负载热分布试验，确认最冷点及达到灭菌条件时间。
3）热分布探头分布图：
将1支探头与温度控制和记录的传感器（冷点）旁，其余探头均匀置于腔室各处，各探头的测温点不得与金属及其他表面接触。
4）分别对照空载热分布及负载热分布测定记录进行灭菌过程温度均匀性的分析，主要看灭菌腔室达到设定的灭菌温度并稳定后（一般3分钟后）至灭菌计时结束期间灭菌室的温度分布情况，在“高低差”栏中找出最大的5个数值并将最高、最低与平均值相比较，找出最大误差。
（3）可接受标准：
确认灭菌温度≥121℃，灭菌时间：30分钟，F0>15，各点的温度在每次灭菌程序运行过程中的差值≤1℃。
5.3.3热穿透试验和生物指示剂挑战性实验
（1）目的：确定装载中的“最冷点”，并肯定该点在灭菌过程中获得充分的无菌保证值。
（2）程序：将探头放入培养基内，分别按负载热分布装载方式进行热穿透试验。其他方法与满载热分布相同，各得出三组数据；生物指示剂挑战性实验随热穿透试验同步进行，将嗜热脂肪杆菌指示剂1支放到非冷点培养基烧瓶内，另一支放到冷点培养基烧瓶内，一起灭菌。
（3）可接受标准：满载状态下，确认灭菌温度121℃，灭菌时间：30分钟，F0≥15将指示剂放在恒温培养箱中培养7天，56-60℃，指示剂应呈紫色。另取一支未灭菌的指示剂，一同培养后，应呈黄色。
5.3.4灭菌效果验证
微生物挑战性试验合格后，按照灭菌程序连续灭三批培养基。其中每批包括营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁琼脂。灭菌后将上述培养基铺成菌碟后进行培养。可接受标准：菌碟应无菌生长。 [科]
【参考文献】
[1]乐正永.无菌检查方法验证资料分析[J].中国现代药物应用，2008（23）.
[2]刘玉军，徐占鳌，梁毅.药品无菌过滤验证的缺陷探析[J].中国药事，2010（06）.
[3]陈西勇，于淑渤，梁宏.无菌药品生产发生微生物污染的因素分析（下）[J].首都医药，2009（08）.
[4]郭绍雄，张祥凤，谢敬东.实施药品生产GMP管理的对策分析[J].中国当代医药，2010（02）5（01）.
[5]王新建，王凤山，王海燕.最终灭菌药品无菌保证体系和参（下转第328页）（上接第300页）数放行的关键因素探讨[J].齐鲁药事，2006（03）.
[6]宋勤，袁林娜.中国药典与欧州药典无菌检查培养基灵敏度的比较实验[J].药物分析杂志，2005（11）.
[7]许华玉，李智勇，王国荣.2005版《中国药典》无菌检查法修订内容的介绍[J].中国药品标准，2005（02）.
[8]徐林.GMP的无菌保证[J].中国医药工业杂志，2000（03）.
[9]赵宏大，谢文，纪绍梅.我国微生物培养基用琼脂的标准研究[J].中国药事，2010（06）.
[10]陈西勇，于淑渤，梁宏.无菌药品生产发生微生物污染的因素分析（上）[J].首都医药，2009（06）.