【摘 要】
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目的 利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得F4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体.方法 根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序.将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达
【机 构】
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新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室,新疆乌鲁木齐830011
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目的 利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得F4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体.方法 根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序.将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达和纯化.将纯化获得的重组蛋白免疫新西兰白兔,在5次免疫后分离血清,ELISA检测抗体效价.抗原亲和纯化出E4ORF1多克隆抗体,Western blot法检测抗体的特异性.结果 成功扩增E4ORF1基因,经测序比对与GenBank序列一致,大小为408 bp,证明成功构建原核重组表达质粒.经鉴定重组蛋白的相对分子质量(Mr)约14000,ELISA检测5次免疫后兔血清抗体效价达1∶320000.Western blot法证明该抗体具较高的特异性.结论 成功表达E4ORF1蛋白,并制备了高特异性的兔抗E4ORF1多克隆抗体.
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