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摘要：调查屠宰场工作环境中非结核分枝杆菌（NTM）流行情况，为在屠宰场及其他NTM散播环境中工作人员的医疗保健工作提供参考。吉林省白城市内多家牲畜屠宰场内地表污水及宰杀的猪、牛肠系膜淋巴结和颌下淋巴结中分离NTM，用细菌分离培养、菌种鉴别培养、生化鉴定及分子生物学鉴定等方法联合鉴定屠宰场内工作环境中的NTM流行情况。屠宰场工作环境中NTM总分离率为2.73%，其中地表污水中NTM分离率为3.50%，猪、牛肠系膜淋巴结NTM分离率为2.80%，颌下淋巴结NTM分离率为2.00%。所分离的NTM中包括常见的致病力较强的母牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌等菌型。屠宰场中的工作人员属NTM的易感高危人群，应加强对该类工作人员NTM的保健防治工作，同时也为其他NTM高危易感环境中工作人员的医疗保障提供参考。
关键词：屠宰场；非结核分枝杆菌；流行情况调查；分离率
中图分类号： S858.23 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.028
非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium， NTM）在临床上常引发与结核病类似的症状，这给该菌感染后的及时诊治带来了困难[1]。该菌属革兰氏阳性菌，染色后不易被酸和酒精脱色，这种特性可以作为临床上对分枝杆菌的初步诊断。该菌虽然广泛存在于环境中，但是其易感人群主要以老人、婴幼儿及长期处于高危环境中的人群为主。屠宰厂内工作人员可能接触带菌的动物器官，其工作环境可能成为NTM的高危易感区域。所以掌握屠宰场工作环境中NTM的分布流行情况，对生产工作人员健康保障工作是十分必要的，也可以为其他高危易感环境中工作人员的疾病防疫工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标准菌株和待检样品 实验所用标准菌株戈登氏分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌均购于中国科学院微生物研究所。胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌为吉林农业大学微生物教研室保存的国际标准株。
待檢样品：吉林省白城市生猪屠宰场、九一三屠宰场、大屯屠宰场、鹤翔肉类屠宰加工厂等多个牲畜屠宰厂生产车间采集地表污水及猪、牛的肠系膜淋巴结与颌下淋巴结作为待检样品。
1.1.2 分离培养基 采用改良罗杰氏培养基（L-J）进行NTM的分离鉴别与扩增培养。培养基按《病原细菌检验技术》中的方法配制。
1.1.3 各种主要试剂 柠檬酸铁铵、亚碲酸钾等生化试剂均购自北京化工厂；酚酞二硫酸三钾购自比利时ACROS化学公司；限制性内切酶、Taq酶等分子生物学试剂购自Takara公司；引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；其他无机化学试剂均为分析纯试剂，购自北京化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养 酸处理法：用十字匀浆器研磨样品，浆液接种于L-J斜面培养基，37℃培养，每3天定期观察，标记生长菌落，抗酸染色做出初步鉴定。8周后仍未生长者或抗酸染色阴性者视为阴性。
1.2.2 细菌鉴定
生物学与生物化学方法鉴定。
生长特性实验：分离菌接种于L-J培养基上，分别在28℃、37℃、45℃条件下培养，定期观察记录生长情况。
菌体产色实验：避光与不避光条件下观察分离菌产色培养结果。
培养基生长实验：观察分离菌于PNB培养基、TCH培养基、5%NaCl培养基、苦味酸培养基、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上生长情况。
生化实验：分别进行耐热触酶、硝酸盐还原、吐温-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、铁离子吸收、亚碲酸盐还原等实验检测分离菌生化特性。
1.2.3分子生物学方法鉴定 采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析方法（PCR-RLFP）对分离菌株进行检测。合成通用引物Tb11：ACCAACGATGGTGTGTCCAT和Tb12：CTTGTCGAACCGCATACCCT扩增NTM的保守序列hsp65片段，反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 1分钟变性，60℃ 1分钟退火，72℃ 1分钟延伸，共30个循环后72℃ 10分钟延伸，扩增得到439bp的目的片段。将扩增产物用限制性内切酶BstEII和HaeIII进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测，分析各分枝杆菌特征性的酶切图谱， 鉴别分枝杆菌类型。
2 结果
2.1 细菌分离培养结果
实验共计检测样品1500份，其中屠宰场生产车间地表污水共计500份，肠系膜淋巴结500份（牛肠系膜淋巴结250份、猪肠系膜淋巴结250份），颌下淋巴结500份（牛颌下淋巴结250份、猪颌下淋巴结250份）。抗酸染色阳性样品共计42份，成功分离扩增共计41株NTM，总分离率2.73%，其中地表污水17株NTM，阳性率为3.50%，牛、猪肠系膜淋巴结14株NTM，阳性率为2.80%，牛、猪颌下淋巴结10株NTM，阳性率为2.00%。分离情况见表1。
2.2 细菌鉴定结果
经多种方法联合鉴定成功分离的菌株中，蟾蜍分枝杆菌12株，胞内分枝杆菌7株，母牛分枝杆菌3株，戈登分枝杆菌9株，龟分枝杆菌脓肿亚种5株，苏加分枝杆菌3株，偶发分枝杆菌2株。其中，地表污水NTM的17份阳性样品中包括蟾蜍分枝杆菌7株，胞内分枝杆菌3株，戈登分枝杆菌5株，苏加分枝杆菌1株，偶发分枝杆菌1株；猪、牛肠系膜淋巴结的14株NTM中包括蟾蜍分枝杆菌3株，胞内分杆菌2株，母牛分枝杆菌1株，戈登分枝杆菌2株，龟分杆菌脓肿亚种4株，苏加分枝杆菌2株；猪、牛颌下淋巴结10株NTM中包括蟾蜍分枝杆菌2株，胞内分枝杆菌2株，母牛分枝杆菌2株，戈登分枝杆菌2株，龟分枝杆菌脓肿亚种1株，偶发分枝杆菌1株。分离情况见表2。 3 讨论
实验结果中，从1500份屠宰场区采集的样品中共分离出41株NTM，其中500份屠宰场内地表污水中共分离出17株NTM，分离率为3.50%，这个比例低于陈超[2]等人在上海生活饮用水中16.7%的NTM分离率。屠宰场中长期接触生物源性NTM，而工作环境中的污水中NTM分离率却低于上海市饮用水中分离率，分析原因可能有三点：一是消毒原因。屠宰场属动物疫源高危区，有日常的消毒预防程序，这可能是主要因素；二是气候原因。本次实验采样时间为北方的寒冬时期，导致屠宰场中污水中NTM分离率低；三是水源原因。水源的不同可能导致NTM分离率的差异。地表污水中分离到的17株NTM中包括的胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌是常见的致病型分枝杆菌[3-5]，说明污水中有一定的NTM致病源存在。本次实验在采集样品同时，还在屠宰车间内敞口放置了20管L-J培养基，最终仅得1株NTM，分离率较低，也不能排除是否有飞溅物质干扰了分离结果，但在牲畜屠宰过程中，工作车间内由于动物热源的释放，会导致大量雾化水蒸汽的出现，这为NTM的飞沫传播创造了条件，所以即使得出屠宰区污水中NTM分离率较低这一结果，也不能对工作环境中的NTM防疫工作掉以轻心。
实验结果中，猪、牛肠系膜淋巴结NTM分离率达到2.80%，低于王铁峰[6]等人的相关报道，但是猪、牛颌下淋巴结NTM分离率为2.00%，又高于王铁峰的相关报道。这两次NTM调查采样的地域气候、样品来源等条件相似，所以肠系膜和颌下淋巴结中NTM分离率的数据差异，可视为一种正常的随机波动。然而王铁峰等人的检测时间为2008年，时隔5年后NTM在吉林省白城市地区的流行情况没有得到明显改善，分析原因可能是由于NTM有较强的耐药性，这也是人医临床在治疗NTM时需要注意的一种现象，所以建议相关防疫工作人员，在进行消杀过程中要定期更换杀菌剂，调整消杀程序，以取得更好的NTM防控效果。
实验中在屠宰场内NTM总分离率达2.73%，分离到的NTM中包含致病力较强的母牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌等，这些都可能和屠宰过程动物源性NTM的释放有关。屠宰生产工作人员，长期暴露在这种环境中，属于高危易感人群，尤其是动物脏器处理程序的工作人员，接触患畜所携带的NTM的几率更高，所以这些工作人员的医疗保健工作中需要加强对NTM的防治工作。
在对屠宰场工作人员的随机调查中，有高龄工作人员患有呼吸系统类结核样疾病，虽然还没有最终确诊，但如果是NTM感染，这也和NTM易感于老人、儿童有一定关系。从各方面看，建议屠宰场不仅需要加强NTM的防治工作，同时有必要做好屠宰工作人员NTM防治知识的普及，提高工作人员的自我防范意识。
目前，对于NTM能够引起人类疾病的报道越来越多，国内外均有NTM对人致病的相关报道[7-10]。而可能经常接触动物源性NTM的屠宰工作人员，正是NTM感染的高危人群之一，所以有必要加强该类人员的NTM医疗防疫工作，同时也有必要通过知识普及等形式，提高该类工作人员的NTM自我防范意识，为其他可能处于NTM高危易感环境中工作人员的NTM防治工作提供参考。
参考文献
[1]杨建华，马丽萍.非结核分枝杆菌感染现状和治疗的探讨[J].医药论坛杂志，2004，25（17）：3-4.
[2]陈超，徐鹏，李静，等.城市生活饮用水中非结核分枝杆菌调查[J].微生物与感染，2008，3（04）：215-218.
[3]Brown B A，Springer B，Steingrube V A，etal. A cooperative
study from the InternationalWorking Group on Mycobacterial Taxonomy[J]. Syst Bacteriol，1999，（49）：1493-1511.
[4]Wallace R J，Musser J M，Hull S I etal.Diversity and sources of rapidly growing mycobacteria associated with infections following cardiac surgery[J]. Infect Dis，1989，（159）：708-716.
[5]Shojaei H，Goodfellow M，Magee J G，etal.Mycobacterium
novocastrense sp nov a rapidly growing photochromogenic Mycobacterium[J]. Syst Bacteriol，1997，（47）：1205-1207.
[6]王鐵峰，张宇，钱爱东.牛非结核分枝杆菌分离与鉴定[J]中国兽医杂志，2011，47（06）：15-17.
[7]杨建华，马丽萍.非结核分枝杆菌感染现状和治疗的探讨[J]医药论坛杂志，2004，25（17）.
[8]Susan T，Thomas F.The rapidly growing mycobacteria：saprophytes and parasites[J].Microbes and Infection，2000，（02）：1845-1853.
[9]Sven Parsons，Sarah G D，Quinton Martins etl.Pulmonary in
fection due to the dassie bacillus in a free-living dassie from South Africa[J].Tuberculosis，2008，（88）：80-83.
[10]Shinnick T M， Good R C.Mycobacterial taxonomy[J].Clin
Microbiol Infect Dis，1994，（13）： 884-901.
通讯作者：王铁峰，博士，白城师范学院生物系，讲师，研究方向：分子生物学。
作者简介：王照，博士，吉林省地方病第一防治研究所，研究员，研究方向：分子生物学；李新殿，硕士，吉林农业大学中药材学院，讲师，研究方向：野生动物保护与利用。
关键词：屠宰场；非结核分枝杆菌；流行情况调查；分离率
中图分类号： S858.23 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.028
非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium， NTM）在临床上常引发与结核病类似的症状，这给该菌感染后的及时诊治带来了困难[1]。该菌属革兰氏阳性菌，染色后不易被酸和酒精脱色，这种特性可以作为临床上对分枝杆菌的初步诊断。该菌虽然广泛存在于环境中，但是其易感人群主要以老人、婴幼儿及长期处于高危环境中的人群为主。屠宰厂内工作人员可能接触带菌的动物器官，其工作环境可能成为NTM的高危易感区域。所以掌握屠宰场工作环境中NTM的分布流行情况，对生产工作人员健康保障工作是十分必要的，也可以为其他高危易感环境中工作人员的疾病防疫工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标准菌株和待检样品 实验所用标准菌株戈登氏分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌均购于中国科学院微生物研究所。胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌为吉林农业大学微生物教研室保存的国际标准株。
待檢样品：吉林省白城市生猪屠宰场、九一三屠宰场、大屯屠宰场、鹤翔肉类屠宰加工厂等多个牲畜屠宰厂生产车间采集地表污水及猪、牛的肠系膜淋巴结与颌下淋巴结作为待检样品。
1.1.2 分离培养基 采用改良罗杰氏培养基（L-J）进行NTM的分离鉴别与扩增培养。培养基按《病原细菌检验技术》中的方法配制。
1.1.3 各种主要试剂 柠檬酸铁铵、亚碲酸钾等生化试剂均购自北京化工厂；酚酞二硫酸三钾购自比利时ACROS化学公司；限制性内切酶、Taq酶等分子生物学试剂购自Takara公司；引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；其他无机化学试剂均为分析纯试剂，购自北京化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养 酸处理法：用十字匀浆器研磨样品，浆液接种于L-J斜面培养基，37℃培养，每3天定期观察，标记生长菌落，抗酸染色做出初步鉴定。8周后仍未生长者或抗酸染色阴性者视为阴性。
1.2.2 细菌鉴定
生物学与生物化学方法鉴定。
生长特性实验：分离菌接种于L-J培养基上，分别在28℃、37℃、45℃条件下培养，定期观察记录生长情况。
菌体产色实验：避光与不避光条件下观察分离菌产色培养结果。
培养基生长实验：观察分离菌于PNB培养基、TCH培养基、5%NaCl培养基、苦味酸培养基、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上生长情况。
生化实验：分别进行耐热触酶、硝酸盐还原、吐温-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、铁离子吸收、亚碲酸盐还原等实验检测分离菌生化特性。
1.2.3分子生物学方法鉴定 采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析方法（PCR-RLFP）对分离菌株进行检测。合成通用引物Tb11：ACCAACGATGGTGTGTCCAT和Tb12：CTTGTCGAACCGCATACCCT扩增NTM的保守序列hsp65片段，反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 1分钟变性，60℃ 1分钟退火，72℃ 1分钟延伸，共30个循环后72℃ 10分钟延伸，扩增得到439bp的目的片段。将扩增产物用限制性内切酶BstEII和HaeIII进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测，分析各分枝杆菌特征性的酶切图谱， 鉴别分枝杆菌类型。
2 结果
2.1 细菌分离培养结果
实验共计检测样品1500份，其中屠宰场生产车间地表污水共计500份，肠系膜淋巴结500份（牛肠系膜淋巴结250份、猪肠系膜淋巴结250份），颌下淋巴结500份（牛颌下淋巴结250份、猪颌下淋巴结250份）。抗酸染色阳性样品共计42份，成功分离扩增共计41株NTM，总分离率2.73%，其中地表污水17株NTM，阳性率为3.50%，牛、猪肠系膜淋巴结14株NTM，阳性率为2.80%，牛、猪颌下淋巴结10株NTM，阳性率为2.00%。分离情况见表1。
2.2 细菌鉴定结果
经多种方法联合鉴定成功分离的菌株中，蟾蜍分枝杆菌12株，胞内分枝杆菌7株，母牛分枝杆菌3株，戈登分枝杆菌9株，龟分枝杆菌脓肿亚种5株，苏加分枝杆菌3株，偶发分枝杆菌2株。其中，地表污水NTM的17份阳性样品中包括蟾蜍分枝杆菌7株，胞内分枝杆菌3株，戈登分枝杆菌5株，苏加分枝杆菌1株，偶发分枝杆菌1株；猪、牛肠系膜淋巴结的14株NTM中包括蟾蜍分枝杆菌3株，胞内分杆菌2株，母牛分枝杆菌1株，戈登分枝杆菌2株，龟分杆菌脓肿亚种4株，苏加分枝杆菌2株；猪、牛颌下淋巴结10株NTM中包括蟾蜍分枝杆菌2株，胞内分枝杆菌2株，母牛分枝杆菌2株，戈登分枝杆菌2株，龟分枝杆菌脓肿亚种1株，偶发分枝杆菌1株。分离情况见表2。 3 讨论
实验结果中，从1500份屠宰场区采集的样品中共分离出41株NTM，其中500份屠宰场内地表污水中共分离出17株NTM，分离率为3.50%，这个比例低于陈超[2]等人在上海生活饮用水中16.7%的NTM分离率。屠宰场中长期接触生物源性NTM，而工作环境中的污水中NTM分离率却低于上海市饮用水中分离率，分析原因可能有三点：一是消毒原因。屠宰场属动物疫源高危区，有日常的消毒预防程序，这可能是主要因素；二是气候原因。本次实验采样时间为北方的寒冬时期，导致屠宰场中污水中NTM分离率低；三是水源原因。水源的不同可能导致NTM分离率的差异。地表污水中分离到的17株NTM中包括的胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌是常见的致病型分枝杆菌[3-5]，说明污水中有一定的NTM致病源存在。本次实验在采集样品同时，还在屠宰车间内敞口放置了20管L-J培养基，最终仅得1株NTM，分离率较低，也不能排除是否有飞溅物质干扰了分离结果，但在牲畜屠宰过程中，工作车间内由于动物热源的释放，会导致大量雾化水蒸汽的出现，这为NTM的飞沫传播创造了条件，所以即使得出屠宰区污水中NTM分离率较低这一结果，也不能对工作环境中的NTM防疫工作掉以轻心。
实验结果中，猪、牛肠系膜淋巴结NTM分离率达到2.80%，低于王铁峰[6]等人的相关报道，但是猪、牛颌下淋巴结NTM分离率为2.00%，又高于王铁峰的相关报道。这两次NTM调查采样的地域气候、样品来源等条件相似，所以肠系膜和颌下淋巴结中NTM分离率的数据差异，可视为一种正常的随机波动。然而王铁峰等人的检测时间为2008年，时隔5年后NTM在吉林省白城市地区的流行情况没有得到明显改善，分析原因可能是由于NTM有较强的耐药性，这也是人医临床在治疗NTM时需要注意的一种现象，所以建议相关防疫工作人员，在进行消杀过程中要定期更换杀菌剂，调整消杀程序，以取得更好的NTM防控效果。
实验中在屠宰场内NTM总分离率达2.73%，分离到的NTM中包含致病力较强的母牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌等，这些都可能和屠宰过程动物源性NTM的释放有关。屠宰生产工作人员，长期暴露在这种环境中，属于高危易感人群，尤其是动物脏器处理程序的工作人员，接触患畜所携带的NTM的几率更高，所以这些工作人员的医疗保健工作中需要加强对NTM的防治工作。
在对屠宰场工作人员的随机调查中，有高龄工作人员患有呼吸系统类结核样疾病，虽然还没有最终确诊，但如果是NTM感染，这也和NTM易感于老人、儿童有一定关系。从各方面看，建议屠宰场不仅需要加强NTM的防治工作，同时有必要做好屠宰工作人员NTM防治知识的普及，提高工作人员的自我防范意识。
目前，对于NTM能够引起人类疾病的报道越来越多，国内外均有NTM对人致病的相关报道[7-10]。而可能经常接触动物源性NTM的屠宰工作人员，正是NTM感染的高危人群之一，所以有必要加强该类人员的NTM医疗防疫工作，同时也有必要通过知识普及等形式，提高该类工作人员的NTM自我防范意识，为其他可能处于NTM高危易感环境中工作人员的NTM防治工作提供参考。
参考文献
[1]杨建华，马丽萍.非结核分枝杆菌感染现状和治疗的探讨[J].医药论坛杂志，2004，25（17）：3-4.
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[6]王鐵峰，张宇，钱爱东.牛非结核分枝杆菌分离与鉴定[J]中国兽医杂志，2011，47（06）：15-17.
[7]杨建华，马丽萍.非结核分枝杆菌感染现状和治疗的探讨[J]医药论坛杂志，2004，25（17）.
[8]Susan T，Thomas F.The rapidly growing mycobacteria：saprophytes and parasites[J].Microbes and Infection，2000，（02）：1845-1853.
[9]Sven Parsons，Sarah G D，Quinton Martins etl.Pulmonary in
fection due to the dassie bacillus in a free-living dassie from South Africa[J].Tuberculosis，2008，（88）：80-83.
[10]Shinnick T M， Good R C.Mycobacterial taxonomy[J].Clin
Microbiol Infect Dis，1994，（13）： 884-901.
通讯作者：王铁峰，博士，白城师范学院生物系，讲师，研究方向：分子生物学。
作者简介：王照，博士，吉林省地方病第一防治研究所，研究员，研究方向：分子生物学；李新殿，硕士，吉林农业大学中药材学院，讲师，研究方向：野生动物保护与利用。