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中图分类号 R692.5;R589.5;R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）20-2458-09
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.05
摘 要 目的：探讨氯化镧对高磷致血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的抑制作用及其机制。方法：在MTT法筛选氯化镧作用浓度及时间的基础上，将人VSMCs分为对照组（1 mmol/L磷溶液）、氯化镧高浓度对照组（1 mmol/L磷溶液+60 μmol/L氯化镧）、模型组（3 mmol/L磷溶液）、氯化钠组（3 mmol/L磷溶液+180 μmol/L氯化钠）、核因子κB（NF-κB）信号通路激动剂+氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+1 μg/mL脂多糖+60 μmol/L氯化镧）、阳性对照组（3 mmol/L磷溶液+100 μmol/L焦磷酸钠）和氯化镧低、中、高浓度组（3 mmol/L磷溶液+15、30、60 μmol/L氯化镧），采用茜素红S染色法和Von Kossa染色法检测经磷溶液作用6 d、相应药物作用2 d后各组细胞的钙化情况，采用Western blot法检测细胞中肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、NF-κB p65、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、平滑肌22α（SM22α）、Runt相关转录因子2（Runx2）蛋白的表达水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA的表达水平。结果：与对照组比较，氯化镧高浓度对照组细胞没有出现钙化，模型组和氯化钠组细胞均出现明显钙化且光密度（OD）值均显著升高（P<0.01），细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白及其mRNA的表達水平和Runx2 mRNA的表达水平以及细胞核中NF-κB p65、Runx2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01），细胞质中IκBα、SM22α蛋白及其mRNA的表达水平和NF-κB p65蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞的钙化均明显改善，OD值均显著降低，上述蛋白及mRNA的表达水平均不同程度逆转（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞出现明显钙化，OD值显著升高，细胞质以及细胞核中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结论：氯化镧可抑制高磷诱导的VSMCs钙化，其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。
关键词 氯化镧;高磷;血管钙化;核因子κB信号通路;人血管平滑肌细胞
Discussion on the Inhibitory Mechanism of Lanthanum Chloride on Vascular Smooth Muscle Cell Calcification Induced by High Phosphorus Based on NF-κB Signaling Pathway
GU Chao1，ZHAO Lulu1，LI Gang1，GAO Yuan1，WANG Shengnan1，LI Xiaojia1，YUAN Xiaorong1，WANG Qiwen1，Baolechaolu2，HAN Ruilan1（1. School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China; 2. Collaborative Innovation Center of Mongolian Medicine，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To discuss the inhibitory effect of lanthanum chloride on the calcification of vascular smooth muscle cells （VSMCs） induced by high phosphorus and its mechanism. METHODS： On the basis of screening the action concentration and time of lanthanum chloride by MTT method， human VSMCs were divided into control group （1 mmol/L phosphorus solution）， lanthanum chloride high concentration control group （1 mmol/L phosphorus solution+60 μmol/L lanthanum chloride）， model group （3 mmol/L phosphorus solution）， sodium chloride group （3 mmol/L phosphorus solution+180 μmol/L sodium chloride）， nuclear factor κB （NF-κB） signaling pathway agonist+lanthanum chloride group （3 mmol/L phosphorus solution+1 μg/mL lipopolysaccharide+60 μmol/L lanthanum chloride）， positive control group （3 mmol/L phosphorus solution+100 μmol/L sodium pyrophosphate）， and lanthanum chloride low， medium， and high concentration groups （3 mmol/L phosphorus solution+15， 30， 60 μmol/L lanthanum chloride）. Alizarin red S staining and Von Kossa staining were used to detect cell calcification in each group after treated with phosphorus solution for 6 d and relevant medicine for 2 d. Western blot assay was used to detect the protein expression of TNF-α receptor associated protein 6 （TRAF6）， nuclear factor κB inhibitor protein α （IκBα）， NF-κB p65， bone morphogenetic protein 2 （BMP-2）， smooth muscle 22 α （SM22α） and Runt related transcription factor 2 （Runx2）. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect mRNA expression of TRAF6， IκBα， BMP-2， SM22α and Runx2. RESULTS： Compared with control group， no cell calcification was observed in the lanthanum chloride high concentration control group， while obvious cell calcification and significant increase of OD value were observed in model group and sodium chloride group （P<0.01）; protein and mRNA expression of TRAF6 and BMP-2 in cytoplasm as well as mRNA expression of Runx2， protein expression of NF-κB p65 and Runx2 in nucleus were significantly increased （P<0.01）; protein and mRNA expression of IκBα and SM22α as well as protein expression of NF-κB p65 in cytoplasm were significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， cell calcification was significantly improved in lanthanum chloride groups and positive control group， while OD values were significantly reduced; the expression levels of the above-mentioned protein and mRNA were reversed to varying degrees （P<0.05 or P<0.01）. Compared with lanthanum chloride high concentration group， obvious cell calcification was observed in NF-κB signaling pathway agonist+lanthanum chloride group， and OD value was significantly increased; the above indexes were significantly reversed in cytoplasm and nucleus （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Lanthanum chloride can inhibit the calcification of VSMCs induced by high phosphorus， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway activation. KEYWORDS Lanthanum chloride; High phosphorus; Vascular calcification; NF-κB signaling pathway;Human vascular smooth muscle cells
全球疾病负担报告显示，2017年慢性肾脏病（CKD）的患病人数约为6.975亿，其中120万人死于肾衰竭，另有140万人死于并发的心血管疾病[1]。已有研究表明，随着肾功能损伤进展到晚期、功能性肾单位量减少、磷酸盐排泄受阻，再加上持续摄入饮食，CKD患者血清磷酸盐浓度将持续升高，最终可能引起血管钙化等并发症的发生，从而导致CKD患者过早死亡[2]。
血管中层钙化是导致CKD患者心血管疾病死亡的关键因素[3]。在高磷条件下，血管平滑肌细胞（VSMCs）能够向成骨样细胞转分化，转分化后的VSMCs可促进钙和磷酸盐沉淀以及磷酸钙晶体生长，进而促进动脉中层钙化[4]。有研究表明，细胞外聚积的磷酸盐能通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路而诱导VSMCs向成骨样细胞转分化，提示这一信号通路可作为抑制血管中层钙化的潜在靶标[5-7]。
本课题组前期已经证明，氢氧化镧可改善CKD高磷血症模型大鼠的肾功能，降低其血清磷含量[8]。除此之外，还发现纳米氢氧化镧与碳酸镧相比具有更高的效价[9]。由于氢氧化镧难溶于水，不适宜用于细胞实验，因此本研究以氯化镧作为研究对象，基于NF-κB信号通路探究其对高磷致VSMCs钙化的影响，旨在为CKD并发症——血管钙化的治疗提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器包括PikoReal 96型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪、Heraeus HERAcell 150i型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），DMi8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司），SpectraMax i3x型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]，AG-245型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），3-18K型台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司），UPHW-Ⅱ-90T型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司），PowerPac HV Power Supply型基础电泳仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]，Odyssey CLX型红外激光成像系统（美国LI-COR公司）等。
1.2 主要药品与试剂
氯化镧对照品（批号298182，纯度99.9%）、脂多糖（LPS）对照品（NF-κB信号通路激动剂，批号L4391，纯度99%）、焦磷酸钠（PPI）对照品（阳性对照，批号S6422，纯度99.0%～103.0%）均购自德国Sigma公司;氯化钠（批号10019308，纯度99.8%）购自国药集团化学试剂有限公司;磷酸二氢钠（批号130310，分析纯）购自无锡市晶科化工有限公司;磷酸氢二钠（批号170925，分析纯）购自上海展云化工有限公司;盐酸（批号20140902，分析纯）购自天津市风船化学試剂科技有限公司;高糖DMEM培养基（批号11995-065）、胎牛血清（批号10099-141）均购自美国Gibco公司;0.25%胰酶（批号CR2011092）、青霉素-链霉素双抗（批号CR2011115）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析试剂盒（批号P0012）、RIPA裂解液（批号P0013B）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批号C1006）均购自上海碧云天生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒（批号DP419）购自天根生化科技（北京）有限公司;ReverTra Ace qPCR RT Kit（批号FSQ-101）、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（批号QPK-201）均购自东洋纺（上海）生物科技有限公司;茜素红S染色液（批号G1452）、Von Kossa染色试剂盒（批号G3282）、兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号K101527P）均购自北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐缓冲液（PBS）（批号PM5090-10）购自北京酷来博科技有限公司;细胞核和细胞质提取试剂盒（批号78833）购自赛默飞世尔科技有限公司;5×loading buffer（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）蛋白上样缓冲液（批号103025）购自北京普莱利基因技术有限公司;兔源肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）单克隆抗体（批号ab40675）、兔源核因子κB抑制蛋白α（IκBα）单克隆抗体（批号ab32518）均购自英国Abcam公司;小鼠源NF-κB p65单克隆抗体（批号6956）购自美国Cell Signaling Technology公司;小鼠源骨形态发生蛋白2（BMP-2）单克隆抗体（批号SC-137087）、小鼠源平滑肌22α（SM22α）单克隆抗体（批号SC-53932）、小鼠源Runt相关转录因子2（Runx2）单克隆抗体（批号SC-101145）均购自北京安诺伦生物科技有限公司;远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（H+L）二抗（批号A23910）、远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批号A23920）均购自美国Abbkine公司;兔源核纤层蛋白A/C（lamin A/C）多克隆抗体（批号10298-1-AP）购自美国Proteintech公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为双蒸水。
1.3 细胞
人VSMCs细胞株购自上海钰博生物科技有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养
将VSMCs用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基（以下简称“完全培养基”）培养于37 ℃、5%CO2培养箱中（培养条件下同），待细胞生长至融合后，将传代第5～7代细胞用于实验。 2.2 磷溶液的制备
称取磷酸二氢钠 1.56 g，以水溶解并定容至50 mL，作为a溶液。另称取磷酸氢二钠3.58 g，以水溶解并定容至50 mL，作为b溶液。取a溶液9.5 mL和b溶液40.5 mL，混合，以盐酸调节pH至7.4，高压灭菌30 min，过0.22 μm滤膜后，分装，于-20 ℃保存。
2.3 氯化镧作用浓度及时间的筛选
采用MTT法进行筛选。取对数生长期细胞，用PBS（pH 7.2～7.4，下同）洗涤后，以完全培养基2 mL重悬，调整细胞密度为1×104 mL-1，以每孔100 ?L接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组（1 mmol/L磷溶液）和不同浓度氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+0、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 μmol/L氯化镧），每组设置4个复孔。对照组和各氯化镧组加入相应磷溶液，持续培养6 d诱导钙化，分别于第4、5、6天时加入相应浓度氯化镧溶液（以水为溶剂），继续培养。于第7天时，弃去各孔培养基，加入新鲜完全培养基，再加入5 mg/mL的MTT溶液20 ?L，继续培养4 h;弃去培养基，加入二甲基亚砜150 ?L，轻轻振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度（A），按如下公式计算细胞的存活率：存活率（%）=氯化镧组A值/对照组A值×100%。选择细胞存活率较高组别对应的浓度和时间作为后续实验氯化镧的作用浓度和时间。实验重复3次。
2.4 分组、造模与给药
取对数生长期细胞，用PBS洗涤后，以完全培养基2 mL重悬，调整细胞密度为1×104 mL-1，以每孔100 ?L接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组（1 mmol/L磷溶液）、氯化镧高浓度对照组（1 mmol/L磷溶液+60 μmol/L氯化镧，氯化镧浓度参考“2.3”项下结果设置，下同）、模型组（3 mmol/L磷溶液）、氯化钠组（3 mmol/L磷溶液+180 μmol/L氯化钠，氯化钠浓度根据人体生理钠浓度0.9%换算而得）、NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+1 μg/mL LPS[10]+60 μmol/L氯化镧）、阳性对照组（3 mmol/L磷溶液+100 μmol/L PPI[11-12]）和氯化镧低、中、高浓度组（3 mmol/L磷溶液+15、30、60 μmol/L氯化镧），每组设置3个复孔。各组用相应浓度的含磷完全培养基培养6 d诱导钙化，并于第5天时加入相应药物，继续培养2 d（作用时间参考“2.3”项下结果设置）。
2.5 VSMCs钙化情况的检测
2.5.1 茜素红S染色 各组细胞用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛溶液2 mL，在37 ℃下固定30 min，弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞，然后加入1%茜素红S染色液（pH 4.2）1 mL，在37 ℃下染色5 min，弃去茜素红S染色液，用PBS洗涤细胞5次，在倒置荧光显微镜下观察（钙沉积阳性细胞呈红色）。然后使用10%乙酸溶液对钙沉淀物进行脱色，使用多功能酶标仪在420 nm波长处测定各孔的光密度（OD）。
2.5.2 Von Kossa染色 各组细胞用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛溶液2 mL，在37 ℃下固定30 min，弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞3次后，按Von Kossa染色试剂盒说明书方法操作，在倒置荧光显微镜下观察（钙沉积物呈黑色）。
2.6 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α、Runx2蛋白表达的影响
采用Western blot法进行检测。收集各组细胞，置于1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液，冰上裂解5 min，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸变性，取变性后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗（TRAF6的稀释比例为1 ∶ 5 000，IκBα的稀释比例为1 ∶ 1 000，NF-κB p65的稀释比例为1 ∶ 500，BMP-2、SM22α、Runx2的稀释比例均为1 ∶ 600，β-actin、lamin A/C的稀释比例均为1 ∶ 2 000），于4 ℃下孵育过夜;用TBST缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均为1 ∶ 2 000），于37 ℃下孵育1 h;用TBST缓冲液洗膜3次后，置于红外激光成像系统下成像。用Image J v1.8.0软件进行分析，计算TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α与内参β-actin的灰度值比值，再与对照组比较表示上述蛋白在细胞质中的表达水平;计算Runx2、NF-κB p65与内参lamin A/C的灰度值比值，再与对照组比较表示上述蛋白在细胞核中的表达水平。实验重复3次。
2.7 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA表达的影响
采用实时荧光定量PCR法进行检测。收集各组细胞，按相应试剂盒说明书方法操作，提取總RNA并将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系（共20 μL）如下：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 ?L，无RNase水6.4 ?L。PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA的表达水平。本实验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成，引物序列及产物长度见表1。 2.8 统计学方法
采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7.0软件对数据进行统计分析并作图。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 氯化镧的作用浓度及时间
随着氯化镧浓度的升高，钙化VSMCs的存活率呈先增加后降低的趋势。作用1 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为15 μmol/L时达到峰值[（155.71±2.02）%];作用2 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为30 μmol/L时达到峰值[（194.23±17.05）%];作用3 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为35 μmol/L时达到峰值[（144.00±11.09）%]。结果见图1。本课题组最终确定后续实验中氯化镧的低、中、高浓度分别为15、30、60 μmol/L，作用时间为2 d。
3.2 氯化镧对VSMCs钙化的影响
茜素红S、Von Kossa染色结果显示，对照组和氯化镧高浓度对照组均无红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物出现，模型组和氯化钠组则可见明显的红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显减少，且氯化镧的作用有浓度依赖的趋势。氯化钠组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显多于氯化镧各浓度组。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显增加。结果见图2、图3。
与对照组比较，模型组和氯化钠组细胞的OD值均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞的OD值均显著降低（P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞的OD值显著升高（P<0.01）。结果见图4。
3.3 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α、Runx2蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组和氯化钠组VSMCs细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白的表达水平均显著升高，IκBα、NF-κB p65、SM22α蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧中、高浓度组和阳性对照组VSMCs细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白的表达水平均显著降低，IκBα、NF-κB p65、SM22α蛋白的表达水平和氯化镧低浓度组细胞质中SM22α蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组VSMCs细胞质中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结果见图5、图6。
与对照组比较，模型组和氯化钠组VSMCs细胞核中Runx2、NF-κB p65蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组VSCMs细胞核中Runx2、NF-κB p65（除氯化镧低、中浓度组NF-κB p65外）蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组VSCMs细胞核中上述指标均显著逆转（P<0.01）。结果见图7、图8。
3.4 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA表达的影响
与对照组比较，模型组和氯化钠组细胞中TRAF6、BMP-2、Runx2 mRNA的表达水平均显著升高，IκBα、SM22α mRNA的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞中TRAF6、BMP-2、Runx2 mRNA的表达水平均显著降低，IκBα（除氯化镧低浓度组外）、SM22α（除氯化镧低浓度组外）mRNA的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结果见图9。
4 讨论
钙在人体内大量存在，在激素分泌、递质释放、肌肉收缩、神经传导等方面均起重要作用[13]。VSMCs向成骨样细胞转分化的过程涉及大量钙盐的生成[14]。钙盐染色常用方法有茜素红S法[15]和Von Kossa法（即硝酸银法）[16]。本研究采用这两种方法检测细胞钙沉积含量，结果显示，低磷不会引起VSMCs钙化，高磷可引起VSMCs钙化，而氯化镧可抑制该钙化的发生。
本课题组前期实验使用的是氢氧化镧，但由于氢氧化镧为混悬剂，难溶于水，不适宜用于细胞实验。为此，本研究选用了可溶于水的氯化镧作为干预物，基于NF-κB信号通路探究其对高磷致VSMCs钙化的影响。另外，为了排除氯离子对实验的影响，本研究还设置了氯化钠组进行对比。结果显示，氯化镧对VSMCs鈣化有明显的抑制作用且有浓度依赖的趋势，而氯化钠对VSMCs钙化并无抑制作用，由此推测发挥抑制作用的主要是镧离子，而不是氯离子。同时，为了考察单用氯化镧对VSMCs钙化的影响，本研究设置了氯化镧高浓度对照组进行对比。结果显示，氯化镧高浓度对照组无红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物出现，表明单用氯化镧对VSMCs钙化无影响。
有研究表明，VSMCs暴露于高磷条件下会诱导NF-κB的活化[17]。NF-κB已成为VSMCs向成骨样细胞转分化的关键调节因子[18]。NF-κB激活可增强碱性磷酸酶活性，上调BMP-2、Runx2表达，从而干扰VSMCs中的抗钙化途径[19]。本研究根据文献[6-7，20-22]筛选NF-κB信号通路的相关蛋白，采用Western blot法考察了氯化镧对高磷致钙化VSMCs中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α和Runx2蛋白表达的影响。结果显示，高磷条件可使VSMCs中TRAF6游离，促进IκBα降解，随后激活NF-κB p65，活化的NF-κB p65转位至细胞核并诱导其靶因子Runx2表达，从而促进VSMCs向成骨样细胞转分化，最终导致血管钙化。氯化镧可通过抑制钙化的VSMCs中TRAF6转录以及IκBα蛋白降解，进而抑制NF-κB入核，从而发挥抑制VSMCs钙化的作用。同时，本研究采用实时荧光定量PCR法考察了氯化镧对高磷致钙化VSMCs中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α和Runx2 mRNA表达的影响，结果与蛋白表达的检测结果基本一致。为进一步验证，本研究设置了NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组进行对比。由于尚无特异性NF-κB激动剂，故本研究参考文献[21]选用LPS作为NF-κB激动剂进行实验。结果显示，与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显增加，表明激活NF-κB信号通路会降低氯化镧对VSMCs钙化的抑制作用。 综上所述，氯化镧可抑制高磷诱导的VSMCs钙化，其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。
参考文献
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（收稿日期：2021-06-15 修回日期：2021-09-13）
（编辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.05
摘 要 目的：探讨氯化镧对高磷致血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的抑制作用及其机制。方法：在MTT法筛选氯化镧作用浓度及时间的基础上，将人VSMCs分为对照组（1 mmol/L磷溶液）、氯化镧高浓度对照组（1 mmol/L磷溶液+60 μmol/L氯化镧）、模型组（3 mmol/L磷溶液）、氯化钠组（3 mmol/L磷溶液+180 μmol/L氯化钠）、核因子κB（NF-κB）信号通路激动剂+氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+1 μg/mL脂多糖+60 μmol/L氯化镧）、阳性对照组（3 mmol/L磷溶液+100 μmol/L焦磷酸钠）和氯化镧低、中、高浓度组（3 mmol/L磷溶液+15、30、60 μmol/L氯化镧），采用茜素红S染色法和Von Kossa染色法检测经磷溶液作用6 d、相应药物作用2 d后各组细胞的钙化情况，采用Western blot法检测细胞中肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、NF-κB p65、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、平滑肌22α（SM22α）、Runt相关转录因子2（Runx2）蛋白的表达水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA的表达水平。结果：与对照组比较，氯化镧高浓度对照组细胞没有出现钙化，模型组和氯化钠组细胞均出现明显钙化且光密度（OD）值均显著升高（P<0.01），细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白及其mRNA的表達水平和Runx2 mRNA的表达水平以及细胞核中NF-κB p65、Runx2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01），细胞质中IκBα、SM22α蛋白及其mRNA的表达水平和NF-κB p65蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞的钙化均明显改善，OD值均显著降低，上述蛋白及mRNA的表达水平均不同程度逆转（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞出现明显钙化，OD值显著升高，细胞质以及细胞核中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结论：氯化镧可抑制高磷诱导的VSMCs钙化，其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。
关键词 氯化镧;高磷;血管钙化;核因子κB信号通路;人血管平滑肌细胞
Discussion on the Inhibitory Mechanism of Lanthanum Chloride on Vascular Smooth Muscle Cell Calcification Induced by High Phosphorus Based on NF-κB Signaling Pathway
GU Chao1，ZHAO Lulu1，LI Gang1，GAO Yuan1，WANG Shengnan1，LI Xiaojia1，YUAN Xiaorong1，WANG Qiwen1，Baolechaolu2，HAN Ruilan1（1. School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China; 2. Collaborative Innovation Center of Mongolian Medicine，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To discuss the inhibitory effect of lanthanum chloride on the calcification of vascular smooth muscle cells （VSMCs） induced by high phosphorus and its mechanism. METHODS： On the basis of screening the action concentration and time of lanthanum chloride by MTT method， human VSMCs were divided into control group （1 mmol/L phosphorus solution）， lanthanum chloride high concentration control group （1 mmol/L phosphorus solution+60 μmol/L lanthanum chloride）， model group （3 mmol/L phosphorus solution）， sodium chloride group （3 mmol/L phosphorus solution+180 μmol/L sodium chloride）， nuclear factor κB （NF-κB） signaling pathway agonist+lanthanum chloride group （3 mmol/L phosphorus solution+1 μg/mL lipopolysaccharide+60 μmol/L lanthanum chloride）， positive control group （3 mmol/L phosphorus solution+100 μmol/L sodium pyrophosphate）， and lanthanum chloride low， medium， and high concentration groups （3 mmol/L phosphorus solution+15， 30， 60 μmol/L lanthanum chloride）. Alizarin red S staining and Von Kossa staining were used to detect cell calcification in each group after treated with phosphorus solution for 6 d and relevant medicine for 2 d. Western blot assay was used to detect the protein expression of TNF-α receptor associated protein 6 （TRAF6）， nuclear factor κB inhibitor protein α （IκBα）， NF-κB p65， bone morphogenetic protein 2 （BMP-2）， smooth muscle 22 α （SM22α） and Runt related transcription factor 2 （Runx2）. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect mRNA expression of TRAF6， IκBα， BMP-2， SM22α and Runx2. RESULTS： Compared with control group， no cell calcification was observed in the lanthanum chloride high concentration control group， while obvious cell calcification and significant increase of OD value were observed in model group and sodium chloride group （P<0.01）; protein and mRNA expression of TRAF6 and BMP-2 in cytoplasm as well as mRNA expression of Runx2， protein expression of NF-κB p65 and Runx2 in nucleus were significantly increased （P<0.01）; protein and mRNA expression of IκBα and SM22α as well as protein expression of NF-κB p65 in cytoplasm were significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， cell calcification was significantly improved in lanthanum chloride groups and positive control group， while OD values were significantly reduced; the expression levels of the above-mentioned protein and mRNA were reversed to varying degrees （P<0.05 or P<0.01）. Compared with lanthanum chloride high concentration group， obvious cell calcification was observed in NF-κB signaling pathway agonist+lanthanum chloride group， and OD value was significantly increased; the above indexes were significantly reversed in cytoplasm and nucleus （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Lanthanum chloride can inhibit the calcification of VSMCs induced by high phosphorus， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway activation. KEYWORDS Lanthanum chloride; High phosphorus; Vascular calcification; NF-κB signaling pathway;Human vascular smooth muscle cells
全球疾病负担报告显示，2017年慢性肾脏病（CKD）的患病人数约为6.975亿，其中120万人死于肾衰竭，另有140万人死于并发的心血管疾病[1]。已有研究表明，随着肾功能损伤进展到晚期、功能性肾单位量减少、磷酸盐排泄受阻，再加上持续摄入饮食，CKD患者血清磷酸盐浓度将持续升高，最终可能引起血管钙化等并发症的发生，从而导致CKD患者过早死亡[2]。
血管中层钙化是导致CKD患者心血管疾病死亡的关键因素[3]。在高磷条件下，血管平滑肌细胞（VSMCs）能够向成骨样细胞转分化，转分化后的VSMCs可促进钙和磷酸盐沉淀以及磷酸钙晶体生长，进而促进动脉中层钙化[4]。有研究表明，细胞外聚积的磷酸盐能通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路而诱导VSMCs向成骨样细胞转分化，提示这一信号通路可作为抑制血管中层钙化的潜在靶标[5-7]。
本课题组前期已经证明，氢氧化镧可改善CKD高磷血症模型大鼠的肾功能，降低其血清磷含量[8]。除此之外，还发现纳米氢氧化镧与碳酸镧相比具有更高的效价[9]。由于氢氧化镧难溶于水，不适宜用于细胞实验，因此本研究以氯化镧作为研究对象，基于NF-κB信号通路探究其对高磷致VSMCs钙化的影响，旨在为CKD并发症——血管钙化的治疗提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器包括PikoReal 96型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪、Heraeus HERAcell 150i型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），DMi8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司），SpectraMax i3x型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]，AG-245型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），3-18K型台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司），UPHW-Ⅱ-90T型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司），PowerPac HV Power Supply型基础电泳仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]，Odyssey CLX型红外激光成像系统（美国LI-COR公司）等。
1.2 主要药品与试剂
氯化镧对照品（批号298182，纯度99.9%）、脂多糖（LPS）对照品（NF-κB信号通路激动剂，批号L4391，纯度99%）、焦磷酸钠（PPI）对照品（阳性对照，批号S6422，纯度99.0%～103.0%）均购自德国Sigma公司;氯化钠（批号10019308，纯度99.8%）购自国药集团化学试剂有限公司;磷酸二氢钠（批号130310，分析纯）购自无锡市晶科化工有限公司;磷酸氢二钠（批号170925，分析纯）购自上海展云化工有限公司;盐酸（批号20140902，分析纯）购自天津市风船化学試剂科技有限公司;高糖DMEM培养基（批号11995-065）、胎牛血清（批号10099-141）均购自美国Gibco公司;0.25%胰酶（批号CR2011092）、青霉素-链霉素双抗（批号CR2011115）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析试剂盒（批号P0012）、RIPA裂解液（批号P0013B）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批号C1006）均购自上海碧云天生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒（批号DP419）购自天根生化科技（北京）有限公司;ReverTra Ace qPCR RT Kit（批号FSQ-101）、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（批号QPK-201）均购自东洋纺（上海）生物科技有限公司;茜素红S染色液（批号G1452）、Von Kossa染色试剂盒（批号G3282）、兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号K101527P）均购自北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐缓冲液（PBS）（批号PM5090-10）购自北京酷来博科技有限公司;细胞核和细胞质提取试剂盒（批号78833）购自赛默飞世尔科技有限公司;5×loading buffer（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）蛋白上样缓冲液（批号103025）购自北京普莱利基因技术有限公司;兔源肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）单克隆抗体（批号ab40675）、兔源核因子κB抑制蛋白α（IκBα）单克隆抗体（批号ab32518）均购自英国Abcam公司;小鼠源NF-κB p65单克隆抗体（批号6956）购自美国Cell Signaling Technology公司;小鼠源骨形态发生蛋白2（BMP-2）单克隆抗体（批号SC-137087）、小鼠源平滑肌22α（SM22α）单克隆抗体（批号SC-53932）、小鼠源Runt相关转录因子2（Runx2）单克隆抗体（批号SC-101145）均购自北京安诺伦生物科技有限公司;远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（H+L）二抗（批号A23910）、远红外DyLight 800荧光标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批号A23920）均购自美国Abbkine公司;兔源核纤层蛋白A/C（lamin A/C）多克隆抗体（批号10298-1-AP）购自美国Proteintech公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为双蒸水。
1.3 细胞
人VSMCs细胞株购自上海钰博生物科技有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养
将VSMCs用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基（以下简称“完全培养基”）培养于37 ℃、5%CO2培养箱中（培养条件下同），待细胞生长至融合后，将传代第5～7代细胞用于实验。 2.2 磷溶液的制备
称取磷酸二氢钠 1.56 g，以水溶解并定容至50 mL，作为a溶液。另称取磷酸氢二钠3.58 g，以水溶解并定容至50 mL，作为b溶液。取a溶液9.5 mL和b溶液40.5 mL，混合，以盐酸调节pH至7.4，高压灭菌30 min，过0.22 μm滤膜后，分装，于-20 ℃保存。
2.3 氯化镧作用浓度及时间的筛选
采用MTT法进行筛选。取对数生长期细胞，用PBS（pH 7.2～7.4，下同）洗涤后，以完全培养基2 mL重悬，调整细胞密度为1×104 mL-1，以每孔100 ?L接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组（1 mmol/L磷溶液）和不同浓度氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+0、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 μmol/L氯化镧），每组设置4个复孔。对照组和各氯化镧组加入相应磷溶液，持续培养6 d诱导钙化，分别于第4、5、6天时加入相应浓度氯化镧溶液（以水为溶剂），继续培养。于第7天时，弃去各孔培养基，加入新鲜完全培养基，再加入5 mg/mL的MTT溶液20 ?L，继续培养4 h;弃去培养基，加入二甲基亚砜150 ?L，轻轻振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度（A），按如下公式计算细胞的存活率：存活率（%）=氯化镧组A值/对照组A值×100%。选择细胞存活率较高组别对应的浓度和时间作为后续实验氯化镧的作用浓度和时间。实验重复3次。
2.4 分组、造模与给药
取对数生长期细胞，用PBS洗涤后，以完全培养基2 mL重悬，调整细胞密度为1×104 mL-1，以每孔100 ?L接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组（1 mmol/L磷溶液）、氯化镧高浓度对照组（1 mmol/L磷溶液+60 μmol/L氯化镧，氯化镧浓度参考“2.3”项下结果设置，下同）、模型组（3 mmol/L磷溶液）、氯化钠组（3 mmol/L磷溶液+180 μmol/L氯化钠，氯化钠浓度根据人体生理钠浓度0.9%换算而得）、NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组（3 mmol/L磷溶液+1 μg/mL LPS[10]+60 μmol/L氯化镧）、阳性对照组（3 mmol/L磷溶液+100 μmol/L PPI[11-12]）和氯化镧低、中、高浓度组（3 mmol/L磷溶液+15、30、60 μmol/L氯化镧），每组设置3个复孔。各组用相应浓度的含磷完全培养基培养6 d诱导钙化，并于第5天时加入相应药物，继续培养2 d（作用时间参考“2.3”项下结果设置）。
2.5 VSMCs钙化情况的检测
2.5.1 茜素红S染色 各组细胞用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛溶液2 mL，在37 ℃下固定30 min，弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞，然后加入1%茜素红S染色液（pH 4.2）1 mL，在37 ℃下染色5 min，弃去茜素红S染色液，用PBS洗涤细胞5次，在倒置荧光显微镜下观察（钙沉积阳性细胞呈红色）。然后使用10%乙酸溶液对钙沉淀物进行脱色，使用多功能酶标仪在420 nm波长处测定各孔的光密度（OD）。
2.5.2 Von Kossa染色 各组细胞用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛溶液2 mL，在37 ℃下固定30 min，弃去多聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞3次后，按Von Kossa染色试剂盒说明书方法操作，在倒置荧光显微镜下观察（钙沉积物呈黑色）。
2.6 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α、Runx2蛋白表达的影响
采用Western blot法进行检测。收集各组细胞，置于1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液，冰上裂解5 min，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸变性，取变性后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗（TRAF6的稀释比例为1 ∶ 5 000，IκBα的稀释比例为1 ∶ 1 000，NF-κB p65的稀释比例为1 ∶ 500，BMP-2、SM22α、Runx2的稀释比例均为1 ∶ 600，β-actin、lamin A/C的稀释比例均为1 ∶ 2 000），于4 ℃下孵育过夜;用TBST缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均为1 ∶ 2 000），于37 ℃下孵育1 h;用TBST缓冲液洗膜3次后，置于红外激光成像系统下成像。用Image J v1.8.0软件进行分析，计算TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α与内参β-actin的灰度值比值，再与对照组比较表示上述蛋白在细胞质中的表达水平;计算Runx2、NF-κB p65与内参lamin A/C的灰度值比值，再与对照组比较表示上述蛋白在细胞核中的表达水平。实验重复3次。
2.7 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA表达的影响
采用实时荧光定量PCR法进行检测。收集各组细胞，按相应试剂盒说明书方法操作，提取總RNA并将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系（共20 μL）如下：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 ?L，无RNase水6.4 ?L。PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA的表达水平。本实验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成，引物序列及产物长度见表1。 2.8 统计学方法
采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7.0软件对数据进行统计分析并作图。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 氯化镧的作用浓度及时间
随着氯化镧浓度的升高，钙化VSMCs的存活率呈先增加后降低的趋势。作用1 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为15 μmol/L时达到峰值[（155.71±2.02）%];作用2 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为30 μmol/L时达到峰值[（194.23±17.05）%];作用3 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为35 μmol/L时达到峰值[（144.00±11.09）%]。结果见图1。本课题组最终确定后续实验中氯化镧的低、中、高浓度分别为15、30、60 μmol/L，作用时间为2 d。
3.2 氯化镧对VSMCs钙化的影响
茜素红S、Von Kossa染色结果显示，对照组和氯化镧高浓度对照组均无红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物出现，模型组和氯化钠组则可见明显的红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显减少，且氯化镧的作用有浓度依赖的趋势。氯化钠组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显多于氯化镧各浓度组。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显增加。结果见图2、图3。
与对照组比较，模型组和氯化钠组细胞的OD值均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞的OD值均显著降低（P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞的OD值显著升高（P<0.01）。结果见图4。
3.3 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α、Runx2蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组和氯化钠组VSMCs细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白的表达水平均显著升高，IκBα、NF-κB p65、SM22α蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧中、高浓度组和阳性对照组VSMCs细胞质中TRAF6、BMP-2蛋白的表达水平均显著降低，IκBα、NF-κB p65、SM22α蛋白的表达水平和氯化镧低浓度组细胞质中SM22α蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组VSMCs细胞质中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结果见图5、图6。
与对照组比较，模型组和氯化钠组VSMCs细胞核中Runx2、NF-κB p65蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组VSCMs细胞核中Runx2、NF-κB p65（除氯化镧低、中浓度组NF-κB p65外）蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组VSCMs细胞核中上述指标均显著逆转（P<0.01）。结果见图7、图8。
3.4 氯化镧对细胞中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA表达的影响
与对照组比较，模型组和氯化钠组细胞中TRAF6、BMP-2、Runx2 mRNA的表达水平均显著升高，IκBα、SM22α mRNA的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，氯化镧各浓度组和阳性对照组细胞中TRAF6、BMP-2、Runx2 mRNA的表达水平均显著降低，IκBα（除氯化镧低浓度组外）、SM22α（除氯化镧低浓度组外）mRNA的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组细胞中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结果见图9。
4 讨论
钙在人体内大量存在，在激素分泌、递质释放、肌肉收缩、神经传导等方面均起重要作用[13]。VSMCs向成骨样细胞转分化的过程涉及大量钙盐的生成[14]。钙盐染色常用方法有茜素红S法[15]和Von Kossa法（即硝酸银法）[16]。本研究采用这两种方法检测细胞钙沉积含量，结果显示，低磷不会引起VSMCs钙化，高磷可引起VSMCs钙化，而氯化镧可抑制该钙化的发生。
本课题组前期实验使用的是氢氧化镧，但由于氢氧化镧为混悬剂，难溶于水，不适宜用于细胞实验。为此，本研究选用了可溶于水的氯化镧作为干预物，基于NF-κB信号通路探究其对高磷致VSMCs钙化的影响。另外，为了排除氯离子对实验的影响，本研究还设置了氯化钠组进行对比。结果显示，氯化镧对VSMCs鈣化有明显的抑制作用且有浓度依赖的趋势，而氯化钠对VSMCs钙化并无抑制作用，由此推测发挥抑制作用的主要是镧离子，而不是氯离子。同时，为了考察单用氯化镧对VSMCs钙化的影响，本研究设置了氯化镧高浓度对照组进行对比。结果显示，氯化镧高浓度对照组无红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物出现，表明单用氯化镧对VSMCs钙化无影响。
有研究表明，VSMCs暴露于高磷条件下会诱导NF-κB的活化[17]。NF-κB已成为VSMCs向成骨样细胞转分化的关键调节因子[18]。NF-κB激活可增强碱性磷酸酶活性，上调BMP-2、Runx2表达，从而干扰VSMCs中的抗钙化途径[19]。本研究根据文献[6-7，20-22]筛选NF-κB信号通路的相关蛋白，采用Western blot法考察了氯化镧对高磷致钙化VSMCs中TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α和Runx2蛋白表达的影响。结果显示，高磷条件可使VSMCs中TRAF6游离，促进IκBα降解，随后激活NF-κB p65，活化的NF-κB p65转位至细胞核并诱导其靶因子Runx2表达，从而促进VSMCs向成骨样细胞转分化，最终导致血管钙化。氯化镧可通过抑制钙化的VSMCs中TRAF6转录以及IκBα蛋白降解，进而抑制NF-κB入核，从而发挥抑制VSMCs钙化的作用。同时，本研究采用实时荧光定量PCR法考察了氯化镧对高磷致钙化VSMCs中TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α和Runx2 mRNA表达的影响，结果与蛋白表达的检测结果基本一致。为进一步验证，本研究设置了NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组进行对比。由于尚无特异性NF-κB激动剂，故本研究参考文献[21]选用LPS作为NF-κB激动剂进行实验。结果显示，与氯化镧高浓度组比较，NF-κB信号通路激动剂+氯化镧组红色钙沉积阳性细胞和黑色钙沉积物均明显增加，表明激活NF-κB信号通路会降低氯化镧对VSMCs钙化的抑制作用。 综上所述，氯化镧可抑制高磷诱导的VSMCs钙化，其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。
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（收稿日期：2021-06-15 修回日期：2021-09-13）
（编辑：邹丽娟）