【摘 要】
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目的 构建小鼠附睾富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Crisp-1)基因的原核表达载体并在大肠杆菌中的表达.方法 从小鼠附睾组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增实验所需的C
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目的 构建小鼠附睾富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Crisp-1)基因的原核表达载体并在大肠杆菌中的表达.方法 从小鼠附睾组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增实验所需的Crisp-1基因片段,将目的 基因克隆至原核表达载体pET28a(+)上,酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌ER2566,经IPTG诱导表达,表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法鉴定.结果 重组表达质粒pET28a(+)-Crisp1经双酶切后,得到2条大小分别为5369bp和660bp的片段,测序结果 证实克隆的基因序列与GeneBank中的Crisp-1序列相符.重组体转化大肠杆菌ER2566后,经IPTG诱导,可表达分子质量(Mr)为30×103的重组蛋白,与预期值相一致.IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高.SDS-PAGE电泳显示表达蛋白主要以包涵体形式存在于胞质中.包涵体经纯化和复性后,Western blot实验表明所获得的重组蛋白具有较好的抗原活性.结论 成功构建重组蛋白Crisp-1,为进一步研究Crisp-1的功能奠定基础.
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