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[摘要]目的 研究松針油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，为揭示松针油的抗胃癌作用机制提供理论和实验基础。方法 采用水蒸气蒸馏法提取松针油。向对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞中加入等体积不同浓度的松针油，培养24 h后进行细胞形态学观察；采用MTT法检测松针油对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，将对数期细胞分为阴性对照组、不同浓度给药组，加入不同浓度的松针油，培养24 h后每孔加MTT 20 μL，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用酶联免疫检测仪在490 nm波长测光密度值（OD值）。 结果 松针油给药浓度越高，存活细胞越少，细胞发生体积变小、变圆、核固缩等形态学变化；MTT实验结果表明：与对照组的OD值相比较，1∶200、1∶300和1∶400给药组的OD值明显下降（P<0.001），1∶500给药组的OD值也有下降，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组的细胞存活率相比较，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500给药组细胞存活率明显下降，差异有统计学意义（P<0.001），半数抑制浓度（IC50）为1.9 mg/mL。 结论 松针油对胃癌SGC-7901细胞增殖有抑制作用，且随松针油浓度升高抑制作用明显增强。
[关键词] 松针油；胃癌；细胞增殖；MTT法
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）03-0001-04
Influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901
WU Dan MENG Na’na HAN Yang LI Lingyu TANG Chunyin
Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901， and to provide a theoretical and experimental basis for revealing the mechanism of anticancer effects of essential oil extracted from pine needles against gastric cancer. Methods Essential oil from pine needles was collected by steam distillation. Equal volume of oil with different concentrations was added into human gastric cancer cell line SGC-7901 during its logarithmic phase， cell morphology was observed after 24 h of cell culture； cell proliferation was detected by MTT assay， cells in logarithmic phase were divided into negative control group and different concentrations groups， oil with different concentrations was added， after 24 hours of cell culture， 20 μL MTT was added into each hole， then after 4 hours of incubation in 37℃， 200 μL of 0.04 mol/L DMSO was added into each hole， optical density（OD） at 490 nm was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The higher the concentration of essential oil extracted from pine needles， the fewer the survival cells， morphological changes including the reduction of volume， turning round， karyopyknosis could be observed in the cells. The result of MTT indicated that the OD of 1：200， 1：300 and 1：400 groups decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the OD of 1：500 group also decreased with statistically significant difference（P<0.01）. The survival rate of cells in 1：200， 1：300， 1：400 and 1：500 decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the inhibitory concentration 50（IC50） was 1.9 mg/mL. Conclusion The essential oil extracted from pine needles can inhibit the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 in a concentration-dependent manner. [Key words] Oil of pine needles； Gastric cancer； Cell proliferation； MTT assay
胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤。全球每年大约有90多万新发的胃癌患者，其中70万以上死于胃癌及其相关疾病，是严重威胁人类生命的恶性肿瘤，胃癌致死率仅次于肺癌，居全球癌症死亡原因的第二位[1-3]。我国属胃癌高发区，中国每年新发胃癌患者超过40万例，每年因胃癌及其相关疾病死亡的人数超过20万人，已成为我国位居首位的恶性肿瘤。近年来新发胃癌患者逐渐呈现年轻化趋势[4，5]。因此，胃癌已成为严重危害人类健康的重大疾病。目前手术、化疗仍是治疗胃癌的主要方法[6-8]，但中西医结合治疗胃癌将是一个必然的发展方向。中医药在治疗胃癌的临床工作中发挥着日益重要的作用，尤其在改善癌前病变[9-11]、减轻放化疗毒副作用[12-15]、防止癌症的转移和复发等方面已经显示出其广阔的应用前景[16，17]。
中药松针（pine needle）为松科（pinaceae）松属（pinus）植物的叶[18]，松针中含有丰富的化学成分，包括氨基酸、黄酮类、木质素、粗蛋白、叶绿素、维生素、粗纤维、可溶性多糖、矿质元素等[19，20]。多项研究表明，松针提取物具有抗氧化[21，22]、抗菌[23]、降血脂[24]、降血糖[25]及抑制肿瘤[26]等药理作用，有很高的药用价值和良好的应用前景。因此松针的深度研发具有重大意义。
研究表明：松针油可以诱导肝癌细胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2参与了松针油诱导的肝癌HepG 2细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控[26]。而松针抑制胃癌细胞增殖的研究未见报道。本实验旨在研究松针油对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响，为研究松针油抗胃癌的作用机制提供理论和实验基础。
1 材料与方法
1.1 药物、细胞系
中药松针购自牡丹江市大药房，人胃癌SGC-7901细胞株由本实验室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 松针油提取 采用水蒸气蒸馏法，松针在实验室阴干后切成小于2 cm的小段，取松针100 g加到1000 mL的圆底烧瓶中，加入750 mL蒸馏水，置于水蒸气蒸馏装置中进行提取，蒸馏4 h，取上层精油，用无水乙醚溶解，无水硫酸钠脱水，得到淡黄色油状液体。
1.2.2 细胞形态学观察 用1640培养基稀释已配好的松针油母液，依据松针油浓度分为1∶200组（4.40 mg/mL）、1∶300组（2.93 mg/mL）、1∶400组（2.20 mg/mL）、1∶500组（1.76 mg/mL）、1∶600组（1.47 mg/mL）；收集对数期的人胃癌SGC-7901细胞配成1×105个/mL细胞悬液，37℃ 5%CO2 培养24 h，吸出培养液，加入等体积的不同浓度的松针油，培养24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.2.3 MTT法檢测松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。MTT法检测：将对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞用 0.25% 胰酶消化，离心去上清，用培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度为106/mL。种96孔板，按每孔104个细胞种板，37℃ 5%CO2 培养24 h。将细胞分为对照组、不同浓度松针油给药组[1∶200组（4.40 mg/mL）、1∶300组（2.93 mg/mL）、1∶400组（2.20 mg/mL）、1∶500组（1.76 mg/mL）、1∶600组（1.47 mg/mL）]；每孔设3个复孔，加入不同浓度的松针油，37℃ 5% CO2培养24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，并增设阴性对照，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用吸管反复吹打使接近结晶颗粒溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长测光密度值（OD值）。
1.3观察指标
在倒置显微镜下观察细胞形态，包括细胞存活与死亡情况、存活细胞间空隙大小的改变、胞浆中变化、细胞形态与体积的改变。通过MTT法检测松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）。
1.4 统计学方法
数据采用GraphPad Prism 5.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，多组间比较使用One Way Anova进行统计学检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 松针油的提取
提取得到淡黄色油状液体，用1640培养基配制稀释浓度为1∶100的松针油母液100 mL，质量浓度为8.8 mg/mL，冷藏备用。
2.2 松针油对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响
经倒置显微镜观察松针油作用24 h后，1∶200给药组细胞基本死亡；其他浓度给药组也有部分细胞死亡。给药浓度越高，存活细胞越少。存活细胞间空隙变大，胞浆中出现颗粒样和空泡样变化，细胞变形伸展，体积变小、变圆，有的呈悬浮状态，见封三图1。
2.3 松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响
2.3.1 松针油对不同组别细胞OD值的影响 与对照组的OD值相比较，1∶200、1∶300和1∶400给药组的OD值明显下降（P<0.001），1∶500给药组的OD值也有下降，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.3.2 松针油对不同组别细胞存活率的影响 与对照组的细胞存活率相比较，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500给药组细胞存活率明显下降，差异有统计学意义（P<0.001），见表2。 2.3.3 松针油对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度（IC50） 松针油对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度（IC50）为1.9 mg/mL，见封三图2。松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有较强的抑制作用，随着给药浓度的升高，对胃癌细胞抑制作用增强。
3 讨论
目前癌症死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的趋势，胃癌占全球癌症死亡原因的第二位，具有发病率高、转移率高、死亡率高的三高特点。胃癌的早期诊断率很低，很多患者在就诊时已处于胃癌中后期，即使进行手术切除患处，仍有一半以上的患者会发生局部复发或转移，因此，胃癌的复发和转移是治疗的主要难点。当前胃癌的常用治疗手段包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗及新近发展起来的分子靶向药物治疗等。然而，外科手术、放疗、化疗等胃癌治疗手段在治疗的同时带来了如肝肾损伤、骨髓抑制等一系列医源性疾病，胃癌的臨床治疗面临着巨大挑战。因此，积极探索与开发胃癌治疗新途径，对胃癌的治疗及改善胃癌患者的生存质量、延长胃癌患者的生存期具有重要的临床意义。
目前的化学合成药物虽然抗肿瘤作用确切，疗效显著，但有不良反应大、长期应用易产生耐药性等缺点。近年来，中医药在肿瘤治疗领域的巨大应用潜力引起人们广泛的关注。中医认为胃癌是由于肝胃不和，气郁血逆，脾运失常，湿痰凝聚，瘀热内蓄成毒，结于胃腑而成癌肿。研究表明：中药扶正祛邪，健脾和胃，补气养血，能够有效保护各器官组织的正常功能，增强机体的免疫力，能明显减轻放疗、化疗的副反应，并且能显著增强肿瘤对放、化疗的敏感性；同时，中药的扶正抗癌作用能够有效抑制癌细胞的增殖、浸润、分化、转移，缓解症状，减轻痛苦，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。中医药具有独特的理论体系和用药方式，与传统的手术、放疗及化疗相比，具有多成分、多环节、多靶点、毒副作用小等特点，在肿瘤治疗方面具有西药所不具备的优势，具有广阔的发展前景。
已有研究表明：松针油可以诱导肝癌细胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2参与了松针油诱导的肝癌HepG 2细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控。本实验研究松针油对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响，结果发现：松针油给药后胃癌细胞产生胞间间隙变大、体积变小、变圆、核固缩等形态学变化；另外，MTT实验结果表明：与对照组的OD值相比较，1∶200、1∶300和1∶400给药组的OD值明显下降（P<0.001），1∶500给药组的OD值也有下降，差异具有统计学意义（P<0.01）；与对照组的细胞存活率相比较，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500给药组细胞存活率明显下降，差异具有统计学意义（P<0.001），半数抑制浓度（IC50）为1.9 mg/mL。松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有抑制作用，且随松针油浓度升高，抑制作用明显增强。
综上所述，松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有显著抑制作用，这为进一步研究松针油抑制胃癌细胞增殖的作用机制奠定了实验基础，也为研究中药及其提取物抗胃癌的应用提供了理论和实验依据。采用松针油抑制胃癌细胞增殖可能是胃癌治疗的一种新策略，为中药抗肿瘤研究开辟了新的途径。
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（收稿日期：2017-11-21）
[关键词] 松针油；胃癌；细胞增殖；MTT法
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）03-0001-04
Influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901
WU Dan MENG Na’na HAN Yang LI Lingyu TANG Chunyin
Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901， and to provide a theoretical and experimental basis for revealing the mechanism of anticancer effects of essential oil extracted from pine needles against gastric cancer. Methods Essential oil from pine needles was collected by steam distillation. Equal volume of oil with different concentrations was added into human gastric cancer cell line SGC-7901 during its logarithmic phase， cell morphology was observed after 24 h of cell culture； cell proliferation was detected by MTT assay， cells in logarithmic phase were divided into negative control group and different concentrations groups， oil with different concentrations was added， after 24 hours of cell culture， 20 μL MTT was added into each hole， then after 4 hours of incubation in 37℃， 200 μL of 0.04 mol/L DMSO was added into each hole， optical density（OD） at 490 nm was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The higher the concentration of essential oil extracted from pine needles， the fewer the survival cells， morphological changes including the reduction of volume， turning round， karyopyknosis could be observed in the cells. The result of MTT indicated that the OD of 1：200， 1：300 and 1：400 groups decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the OD of 1：500 group also decreased with statistically significant difference（P<0.01）. The survival rate of cells in 1：200， 1：300， 1：400 and 1：500 decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the inhibitory concentration 50（IC50） was 1.9 mg/mL. Conclusion The essential oil extracted from pine needles can inhibit the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 in a concentration-dependent manner. [Key words] Oil of pine needles； Gastric cancer； Cell proliferation； MTT assay
胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤。全球每年大约有90多万新发的胃癌患者，其中70万以上死于胃癌及其相关疾病，是严重威胁人类生命的恶性肿瘤，胃癌致死率仅次于肺癌，居全球癌症死亡原因的第二位[1-3]。我国属胃癌高发区，中国每年新发胃癌患者超过40万例，每年因胃癌及其相关疾病死亡的人数超过20万人，已成为我国位居首位的恶性肿瘤。近年来新发胃癌患者逐渐呈现年轻化趋势[4，5]。因此，胃癌已成为严重危害人类健康的重大疾病。目前手术、化疗仍是治疗胃癌的主要方法[6-8]，但中西医结合治疗胃癌将是一个必然的发展方向。中医药在治疗胃癌的临床工作中发挥着日益重要的作用，尤其在改善癌前病变[9-11]、减轻放化疗毒副作用[12-15]、防止癌症的转移和复发等方面已经显示出其广阔的应用前景[16，17]。
中药松针（pine needle）为松科（pinaceae）松属（pinus）植物的叶[18]，松针中含有丰富的化学成分，包括氨基酸、黄酮类、木质素、粗蛋白、叶绿素、维生素、粗纤维、可溶性多糖、矿质元素等[19，20]。多项研究表明，松针提取物具有抗氧化[21，22]、抗菌[23]、降血脂[24]、降血糖[25]及抑制肿瘤[26]等药理作用，有很高的药用价值和良好的应用前景。因此松针的深度研发具有重大意义。
研究表明：松针油可以诱导肝癌细胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2参与了松针油诱导的肝癌HepG 2细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控[26]。而松针抑制胃癌细胞增殖的研究未见报道。本实验旨在研究松针油对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响，为研究松针油抗胃癌的作用机制提供理论和实验基础。
1 材料与方法
1.1 药物、细胞系
中药松针购自牡丹江市大药房，人胃癌SGC-7901细胞株由本实验室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 松针油提取 采用水蒸气蒸馏法，松针在实验室阴干后切成小于2 cm的小段，取松针100 g加到1000 mL的圆底烧瓶中，加入750 mL蒸馏水，置于水蒸气蒸馏装置中进行提取，蒸馏4 h，取上层精油，用无水乙醚溶解，无水硫酸钠脱水，得到淡黄色油状液体。
1.2.2 细胞形态学观察 用1640培养基稀释已配好的松针油母液，依据松针油浓度分为1∶200组（4.40 mg/mL）、1∶300组（2.93 mg/mL）、1∶400组（2.20 mg/mL）、1∶500组（1.76 mg/mL）、1∶600组（1.47 mg/mL）；收集对数期的人胃癌SGC-7901细胞配成1×105个/mL细胞悬液，37℃ 5%CO2 培养24 h，吸出培养液，加入等体积的不同浓度的松针油，培养24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.2.3 MTT法檢测松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。MTT法检测：将对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞用 0.25% 胰酶消化，离心去上清，用培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度为106/mL。种96孔板，按每孔104个细胞种板，37℃ 5%CO2 培养24 h。将细胞分为对照组、不同浓度松针油给药组[1∶200组（4.40 mg/mL）、1∶300组（2.93 mg/mL）、1∶400组（2.20 mg/mL）、1∶500组（1.76 mg/mL）、1∶600组（1.47 mg/mL）]；每孔设3个复孔，加入不同浓度的松针油，37℃ 5% CO2培养24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，并增设阴性对照，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用吸管反复吹打使接近结晶颗粒溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长测光密度值（OD值）。
1.3观察指标
在倒置显微镜下观察细胞形态，包括细胞存活与死亡情况、存活细胞间空隙大小的改变、胞浆中变化、细胞形态与体积的改变。通过MTT法检测松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）。
1.4 统计学方法
数据采用GraphPad Prism 5.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，多组间比较使用One Way Anova进行统计学检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 松针油的提取
提取得到淡黄色油状液体，用1640培养基配制稀释浓度为1∶100的松针油母液100 mL，质量浓度为8.8 mg/mL，冷藏备用。
2.2 松针油对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响
经倒置显微镜观察松针油作用24 h后，1∶200给药组细胞基本死亡；其他浓度给药组也有部分细胞死亡。给药浓度越高，存活细胞越少。存活细胞间空隙变大，胞浆中出现颗粒样和空泡样变化，细胞变形伸展，体积变小、变圆，有的呈悬浮状态，见封三图1。
2.3 松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响
2.3.1 松针油对不同组别细胞OD值的影响 与对照组的OD值相比较，1∶200、1∶300和1∶400给药组的OD值明显下降（P<0.001），1∶500给药组的OD值也有下降，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.3.2 松针油对不同组别细胞存活率的影响 与对照组的细胞存活率相比较，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500给药组细胞存活率明显下降，差异有统计学意义（P<0.001），见表2。 2.3.3 松针油对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度（IC50） 松针油对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度（IC50）为1.9 mg/mL，见封三图2。松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有较强的抑制作用，随着给药浓度的升高，对胃癌细胞抑制作用增强。
3 讨论
目前癌症死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的趋势，胃癌占全球癌症死亡原因的第二位，具有发病率高、转移率高、死亡率高的三高特点。胃癌的早期诊断率很低，很多患者在就诊时已处于胃癌中后期，即使进行手术切除患处，仍有一半以上的患者会发生局部复发或转移，因此，胃癌的复发和转移是治疗的主要难点。当前胃癌的常用治疗手段包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗及新近发展起来的分子靶向药物治疗等。然而，外科手术、放疗、化疗等胃癌治疗手段在治疗的同时带来了如肝肾损伤、骨髓抑制等一系列医源性疾病，胃癌的臨床治疗面临着巨大挑战。因此，积极探索与开发胃癌治疗新途径，对胃癌的治疗及改善胃癌患者的生存质量、延长胃癌患者的生存期具有重要的临床意义。
目前的化学合成药物虽然抗肿瘤作用确切，疗效显著，但有不良反应大、长期应用易产生耐药性等缺点。近年来，中医药在肿瘤治疗领域的巨大应用潜力引起人们广泛的关注。中医认为胃癌是由于肝胃不和，气郁血逆，脾运失常，湿痰凝聚，瘀热内蓄成毒，结于胃腑而成癌肿。研究表明：中药扶正祛邪，健脾和胃，补气养血，能够有效保护各器官组织的正常功能，增强机体的免疫力，能明显减轻放疗、化疗的副反应，并且能显著增强肿瘤对放、化疗的敏感性；同时，中药的扶正抗癌作用能够有效抑制癌细胞的增殖、浸润、分化、转移，缓解症状，减轻痛苦，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。中医药具有独特的理论体系和用药方式，与传统的手术、放疗及化疗相比，具有多成分、多环节、多靶点、毒副作用小等特点，在肿瘤治疗方面具有西药所不具备的优势，具有广阔的发展前景。
已有研究表明：松针油可以诱导肝癌细胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2参与了松针油诱导的肝癌HepG 2细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控。本实验研究松针油对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响，结果发现：松针油给药后胃癌细胞产生胞间间隙变大、体积变小、变圆、核固缩等形态学变化；另外，MTT实验结果表明：与对照组的OD值相比较，1∶200、1∶300和1∶400给药组的OD值明显下降（P<0.001），1∶500给药组的OD值也有下降，差异具有统计学意义（P<0.01）；与对照组的细胞存活率相比较，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500给药组细胞存活率明显下降，差异具有统计学意义（P<0.001），半数抑制浓度（IC50）为1.9 mg/mL。松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有抑制作用，且随松针油浓度升高，抑制作用明显增强。
综上所述，松针油对人胃癌SGC-7901细胞增殖有显著抑制作用，这为进一步研究松针油抑制胃癌细胞增殖的作用机制奠定了实验基础，也为研究中药及其提取物抗胃癌的应用提供了理论和实验依据。采用松针油抑制胃癌细胞增殖可能是胃癌治疗的一种新策略，为中药抗肿瘤研究开辟了新的途径。
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（收稿日期：2017-11-21）