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摘要：从蓝莓根际土壤中筛选出4种植物根际促生细菌（PGPR）L12、L13、L14和L15。通过蓝莓盆栽试验，研究了这4株PGPR对蓝莓根际土壤养分与微生物数量的影响。结果表明，在蓝莓的一个生长周期内，L13和L14能够显著增加蓝莓根际土壤中的可培养微生物数量，而接种L12和L15降低了蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量；接种4株PGPR均能增加土壤有机质含量。L13对土壤速效养分具有明显的促进作用，增加幅度为5.05%～22.27%；菌株L15、L14、L13对土壤酶活性的影响较大。综合以上分析，L13能够明显改善蓝莓根际土壤的养分状况和提高根际土壤微生物数量，具有良好的应用潜力。
关键词：蓝莓；植物根际促生菌；土壤养分；微生物数量；土壤酶活性
中图分类号：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0066-04
植物根际促生细菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR）是在植物根际系统定殖，能够显著促进植物生长或抑制病原菌活动的一类有益细菌的总称[1，2]。它不仅具有普通土壤微生物的促进有机质分解与转化、养分循环和吸收等作用[3]，还对植物生长及病害防治有极其显著的作用[4，5]。近年来研究证明，PGPR可以固定空气中的氮气，提高土壤可溶性磷[6]、分泌或诱导植物产生生长调节物质（如IAA、GA等）、促进植物根系生长和养分吸收利用、增强植物对病原菌和环境胁迫的抗性、忍耐力和适应性等功能[3，7]。
蓝莓（Vacciniumssp.L.），又名越橘、蓝浆果，属杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）浆果类经济林木。其天然资源丰富，风味独特，而且具有相当好的营养保健功效，有“水果皇后”美誉，经济价值极高。蓝莓具有根毛少、根浅等特性，根系多分布于浅层土壤中，要求土壤疏松，有机质含量必须在3%以上，土壤pH值在4.0～5.0之间[8]。由于蓝莓栽培条件较为苛刻，有必要对土壤有机质含量、酸碱度、微生物及环境条件等进行改良。接种PGPR，可以提高作物品质与产量，普遍认为是一种环境友好、经济有效的措施[9]。本研究利用从蓝莓根际土壤中筛选出的几种PGPR，结合蓝莓盆栽试验，分析其对蓝莓土壤养分与微生物数量的影响，确定利于蓝莓生长的优良菌株，可为蓝莓PGPR生物肥的研制与应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验于2011年3月中旬至10月在山东省林业科学研究院试验苗圃进行。土壤为潮土，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为27.96、26.52、79.00mg/kg，有机质含量为6.83g/kg。
1.2供试材料
供试材料为半高丛兔眼蓝莓一年生组培苗，青岛沃林蓝莓基地提供。4株PGPR（L12、L13、L14和L15）是山东省林业科学研究院与山东农业大学从蓝莓根际土壤中利用保绿法和萝卜子叶增重法分别筛选获得；将筛选出的细菌分离物分别接种到NA液体培养基，37℃、180r/min摇床培养48h。利用平板计数法测定每毫升含菌量，计算菌液浓度，并用无菌水稀释至2×108cfu/ml。
1.3试验设计
采取盆栽试验，随机区组设计，共设置5个处理：处理1，对照（CK）；处理2，L12；处理3，L13；处理4，L14；处理5，L15。使用聚乙烯盆（30cm×25cm），按照草炭与土体积比1∶3，硫磺粉15g，将土壤、草炭、硫磺混匀，装盆备用。定植蓝莓苗，并分别将4种菌液与水按1∶2的比例混匀，按照每盆40亿微生物总量浇入，处理1用相同体积的无菌水代替，每处理重复5次，正常管理。
1.4样品采集及测定方法
2013年9月27日采用剥离法采集根际土：先带土取出植株，轻轻抖落大块不含根系的土壤（非根际土），然后用力将根表面附着土壤全部抖落下来，迅速装入塑料袋内（根际土）。采集的根际土样分为2份，一份自然风干、过2mm筛，用于测定土壤化学性质，另一份于实验室测定土壤微生物。土壤微生物种群数量测定采用稀释涂布平板法，测定细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；测定真菌采用马丁培养基+孟加拉红+硫酸链霉素；测定放线菌采用改良高氏1号培养基+重铬酸钾。
土壤EC采用电位法（水土比1∶5）测定；碱解氮、有效磷、速效钾的测定分别采用碱解扩散法、0.5mol/LNaHCO3浸提-钼锑抗比色法、1mol/LNH4OAc浸提-火焰光度法；土壤有机质采用重铬酸钾容量法—外加热法[10]。土壤脲酶采用苯酚钠比色法，以培养24h后1g土壤中NH3-N的质量（mg）表示脲酶活性（U）；土壤过氧化氢酶（CAT）采用高锰酸钾滴定容量法，以20min后1g土壤消耗的0.02mol/LKMnO4的体积（ml）表示；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法，以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）；土壤碱性磷酸酶用磷酸苯二钠比色法，以培养24h后1g土壤中释出酚的质量（mg）表示[11]。
1.5数据统计与分析
采用Word2003制作图表，DPSv7.05软件进行数据统计。
2结果与分析
2.1不同菌株处理对土壤微生物数量的影响
利用稀释平板计数法测定的微生物数量占微生物总种群数的0.01%～10%，虽然不能反映土壤中微生物的绝对数量，但其数量同样对土壤生态环境具有重要参考意义[12]。一定程度上，土壤微生物的数量、类型及其变化反映了土壤有机碳的矿化速率及各种土壤养分的存在状态，同时微生物种群结构失衡是导致作物减产、土壤质量下降、生态系统物质与能量循环被破坏的主要原因之一[13]。向土壤添加一定量的微生物，可能起促进作用，增加土壤微生物种群类型及数量，也可能引起微生物种群间的竞争，减少土壤微生物的种群类型及数量。表1显示的是蓝莓一个生长周期的土壤微生物数量。处理L14的细菌数量最高，但与处理L13差异不显著，处理L13、L14均显著高于其他处理。放线菌数量介于细菌、真菌之间，且4个处理之间差异显著，与CK相比，处理L14、L12、L13分别增加了334.57%、108.64%、61.73%。试验测得真菌数量明显小于细菌、放线菌数量，处理L13比处理L14、L15、CK、L12分别增加了10.88%、30.82%、52.46%、65.90%。微生物总量的规律与细菌、真菌变化规律基本一致，表现为处理L14>L13>CK>L12>L15。 3结论与讨论
本试验结果表明：在蓝莓的一个生长周期内，接种菌株L14和L13能够显著增加蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量，而接种菌株L12和L15降低了蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量；接种各菌株均能增加土壤有机质含量，L13对土壤速效养分含量具有明显的促进作用；菌株L15、L14、L13对土壤酶活性的影响较大。综合来看：L13能够明显改善蓝莓根际土壤的养分状况和改变根际土壤微生物，具有良好的应用潜力。
土壤酶是一个非常敏感的指标，施肥种类、管理与耕作方式、作物种类、土壤水分和环境条件等均可能影响其活性[16]。因此，用土壤酶活性作为评价PGPR菌株对土壤生物学特性的影响情况比较复杂，应结合土壤微生物性状的试验结果做不同分析。刘方春等人研究了植物根际促生细菌对樱桃根际土壤微生物数量的影响，结果发现，植物根际促生细菌可显著提高樱桃根际土壤中的细菌数量，真菌数量显著减少[5]。本研究L12和L15降低了蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量。其结果的差异一方面可能与PGPR种类与植物种类有关，另一方面也可能是稀释平板法的局限性造成的。土壤中可培养微生物的比例极低，目前已从传统的微生物分离培养发展到荧光技术、PCR-RFLP和PLFA图谱分析方法等[15]。因此，评价蓝莓PGPR菌株对根际土壤微生物多样性的影响，还应进一步采用多种方法开展研究。
在土壤中接种PGPR只要能存活，无论是否改变微生物群落结构，都会在一定程度上影响群落的代谢活性[17]。PGPR在植物根围聚集，它们旺盛的代谢作用加强了土壤中有机物质的分解，促进了植物营养元素的矿化，增强了对作物营养的供应[18]。尽管L13处理能够明显改善蓝莓根际土壤的养分状况和提高根际土壤微生物数量，但未必能完全证明它能够在蓝莓根际土壤中存活和定殖，因为其菌液中的代谢产物也有可能产生同样的效果。因此，有必要对L13在蓝莓根际土壤中的存活和定殖规律、促进蓝莓根际土壤养分活化及生物性状的作用机理进一步探讨。
参考文献：
[1]VermaJP，YadavJ，TiwariKN，etal.Impactofplantgrowthpromotingrhizobacteriaoncropproduction[J].InternationalJournalofAgriculturalResearch，2010，5：954-983.
[2]WeyensN，LelieDVD，TaghaviS，etal.Exploitingplant-microbepartnershipstoimprovebiomassproductionandremediation[J].TrendsBiotechnol.，2009，27：591-598.
[3]荣良燕，姚拓，黄高宝，等.植物根际优良促生菌（PGPR）筛选及其接种剂部分替代化肥对玉米生长影响研究[J].干旱地区农业研究，2013，31（2）：59-65.
[4]刘方春，邢尚军，马海林，等.根际促生细菌（PGPR）对冬枣根际土壤微生物数量及细菌多样性影响[J].林业科学，2013，49（8）：75-80.
[5]刘方春，邢尚军，马海林，等.PGPR生物肥对甜樱桃（Cerasuspseudocerasus）根际土壤生物学特征的影响[J].应用与环境生物学报，2012，18（5）：722-727.
[6]KloepperJW，LeongJ，TeintzeM，etal.Enhancedplantgrowthbysiderophoresproducedbyplantgrowth-promotingrhizobacteria[J].Nature，1980，286：885-886.
[7]LiuH，WuXQ，RenJH，etal.IsolationandidentificationofphosphobacteriainpoplarrhizospherefromdifferentregionsofChina[J].Pedosphere，2011，21（1）：90-97.
[8]和阳，杨巍，刘双，等.蓝莓栽培中土壤改良的方法及作用[J].北方园艺，2010，14：46-48.
[9]AbbasiMK，SharifS，KazmiM，etal.Isolationofplantgrowthpromotingrhizobacteriafromwheatrhizosphereandtheireffectonimprovinggrowth，yieldandnutrientuptakeofplants[J].PlantBiosystems，2011，145（1）：159-168.
[10]鲍士旦.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，2000，25-108.
[11]关松荫.土壤酶及其研究方法[M].北京：农业出版社，1986，3-25.
[12]宋洪宁，杜秉海，张明岩，等.环境因素对东平湖沉积物细菌群落结构的影响[J].微生物学报，2010，50（8）：1065-1071.
[13]刘来，黄保健，孙锦，等.大棚辣椒连作土壤微生物数量、酶活性与土壤肥力的关系[J].中国土壤与肥料，2013，2：5-10.
[14]刘善江，夏雪，陈桂梅，等.土壤酶的研究进展[J].中国农学通报，2011，27（21）：1-7.
[15]杨成德，龙瑞军，陈秀蓉，等.土壤微生物功能群及其研究进展[J].土壤通报，2008，39（2）：421-425.
[16]郭文文，诸葛玉平，李建勇，等.转基因番茄栽培对土壤生物学特性的影响[J].山东农业科学，2010，3：46-50.
[17]RamosB，GarciaJAL，ProbanzaA，etal.AlterationsintherhizobacterialcommunityassociatedwithEuropeanaldergrowthwheninoculatedwithPGPRstrainBacillusucheniformis[J].EnvironmentalandExperimentalBotany，2003，49（1）：61-68.
[18]刘方春，邢尚军，马海林，等.生物肥对冬枣根际土壤微环境特征的影响[J].北京林业大学学报，2012，34（5）：100-104.
关键词：蓝莓；植物根际促生菌；土壤养分；微生物数量；土壤酶活性
中图分类号：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0066-04
植物根际促生细菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR）是在植物根际系统定殖，能够显著促进植物生长或抑制病原菌活动的一类有益细菌的总称[1，2]。它不仅具有普通土壤微生物的促进有机质分解与转化、养分循环和吸收等作用[3]，还对植物生长及病害防治有极其显著的作用[4，5]。近年来研究证明，PGPR可以固定空气中的氮气，提高土壤可溶性磷[6]、分泌或诱导植物产生生长调节物质（如IAA、GA等）、促进植物根系生长和养分吸收利用、增强植物对病原菌和环境胁迫的抗性、忍耐力和适应性等功能[3，7]。
蓝莓（Vacciniumssp.L.），又名越橘、蓝浆果，属杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）浆果类经济林木。其天然资源丰富，风味独特，而且具有相当好的营养保健功效，有“水果皇后”美誉，经济价值极高。蓝莓具有根毛少、根浅等特性，根系多分布于浅层土壤中，要求土壤疏松，有机质含量必须在3%以上，土壤pH值在4.0～5.0之间[8]。由于蓝莓栽培条件较为苛刻，有必要对土壤有机质含量、酸碱度、微生物及环境条件等进行改良。接种PGPR，可以提高作物品质与产量，普遍认为是一种环境友好、经济有效的措施[9]。本研究利用从蓝莓根际土壤中筛选出的几种PGPR，结合蓝莓盆栽试验，分析其对蓝莓土壤养分与微生物数量的影响，确定利于蓝莓生长的优良菌株，可为蓝莓PGPR生物肥的研制与应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验于2011年3月中旬至10月在山东省林业科学研究院试验苗圃进行。土壤为潮土，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为27.96、26.52、79.00mg/kg，有机质含量为6.83g/kg。
1.2供试材料
供试材料为半高丛兔眼蓝莓一年生组培苗，青岛沃林蓝莓基地提供。4株PGPR（L12、L13、L14和L15）是山东省林业科学研究院与山东农业大学从蓝莓根际土壤中利用保绿法和萝卜子叶增重法分别筛选获得；将筛选出的细菌分离物分别接种到NA液体培养基，37℃、180r/min摇床培养48h。利用平板计数法测定每毫升含菌量，计算菌液浓度，并用无菌水稀释至2×108cfu/ml。
1.3试验设计
采取盆栽试验，随机区组设计，共设置5个处理：处理1，对照（CK）；处理2，L12；处理3，L13；处理4，L14；处理5，L15。使用聚乙烯盆（30cm×25cm），按照草炭与土体积比1∶3，硫磺粉15g，将土壤、草炭、硫磺混匀，装盆备用。定植蓝莓苗，并分别将4种菌液与水按1∶2的比例混匀，按照每盆40亿微生物总量浇入，处理1用相同体积的无菌水代替，每处理重复5次，正常管理。
1.4样品采集及测定方法
2013年9月27日采用剥离法采集根际土：先带土取出植株，轻轻抖落大块不含根系的土壤（非根际土），然后用力将根表面附着土壤全部抖落下来，迅速装入塑料袋内（根际土）。采集的根际土样分为2份，一份自然风干、过2mm筛，用于测定土壤化学性质，另一份于实验室测定土壤微生物。土壤微生物种群数量测定采用稀释涂布平板法，测定细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；测定真菌采用马丁培养基+孟加拉红+硫酸链霉素；测定放线菌采用改良高氏1号培养基+重铬酸钾。
土壤EC采用电位法（水土比1∶5）测定；碱解氮、有效磷、速效钾的测定分别采用碱解扩散法、0.5mol/LNaHCO3浸提-钼锑抗比色法、1mol/LNH4OAc浸提-火焰光度法；土壤有机质采用重铬酸钾容量法—外加热法[10]。土壤脲酶采用苯酚钠比色法，以培养24h后1g土壤中NH3-N的质量（mg）表示脲酶活性（U）；土壤过氧化氢酶（CAT）采用高锰酸钾滴定容量法，以20min后1g土壤消耗的0.02mol/LKMnO4的体积（ml）表示；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法，以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）；土壤碱性磷酸酶用磷酸苯二钠比色法，以培养24h后1g土壤中释出酚的质量（mg）表示[11]。
1.5数据统计与分析
采用Word2003制作图表，DPSv7.05软件进行数据统计。
2结果与分析
2.1不同菌株处理对土壤微生物数量的影响
利用稀释平板计数法测定的微生物数量占微生物总种群数的0.01%～10%，虽然不能反映土壤中微生物的绝对数量，但其数量同样对土壤生态环境具有重要参考意义[12]。一定程度上，土壤微生物的数量、类型及其变化反映了土壤有机碳的矿化速率及各种土壤养分的存在状态，同时微生物种群结构失衡是导致作物减产、土壤质量下降、生态系统物质与能量循环被破坏的主要原因之一[13]。向土壤添加一定量的微生物，可能起促进作用，增加土壤微生物种群类型及数量，也可能引起微生物种群间的竞争，减少土壤微生物的种群类型及数量。表1显示的是蓝莓一个生长周期的土壤微生物数量。处理L14的细菌数量最高，但与处理L13差异不显著，处理L13、L14均显著高于其他处理。放线菌数量介于细菌、真菌之间，且4个处理之间差异显著，与CK相比，处理L14、L12、L13分别增加了334.57%、108.64%、61.73%。试验测得真菌数量明显小于细菌、放线菌数量，处理L13比处理L14、L15、CK、L12分别增加了10.88%、30.82%、52.46%、65.90%。微生物总量的规律与细菌、真菌变化规律基本一致，表现为处理L14>L13>CK>L12>L15。 3结论与讨论
本试验结果表明：在蓝莓的一个生长周期内，接种菌株L14和L13能够显著增加蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量，而接种菌株L12和L15降低了蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量；接种各菌株均能增加土壤有机质含量，L13对土壤速效养分含量具有明显的促进作用；菌株L15、L14、L13对土壤酶活性的影响较大。综合来看：L13能够明显改善蓝莓根际土壤的养分状况和改变根际土壤微生物，具有良好的应用潜力。
土壤酶是一个非常敏感的指标，施肥种类、管理与耕作方式、作物种类、土壤水分和环境条件等均可能影响其活性[16]。因此，用土壤酶活性作为评价PGPR菌株对土壤生物学特性的影响情况比较复杂，应结合土壤微生物性状的试验结果做不同分析。刘方春等人研究了植物根际促生细菌对樱桃根际土壤微生物数量的影响，结果发现，植物根际促生细菌可显著提高樱桃根际土壤中的细菌数量，真菌数量显著减少[5]。本研究L12和L15降低了蓝莓根际土壤中可培养微生物的数量。其结果的差异一方面可能与PGPR种类与植物种类有关，另一方面也可能是稀释平板法的局限性造成的。土壤中可培养微生物的比例极低，目前已从传统的微生物分离培养发展到荧光技术、PCR-RFLP和PLFA图谱分析方法等[15]。因此，评价蓝莓PGPR菌株对根际土壤微生物多样性的影响，还应进一步采用多种方法开展研究。
在土壤中接种PGPR只要能存活，无论是否改变微生物群落结构，都会在一定程度上影响群落的代谢活性[17]。PGPR在植物根围聚集，它们旺盛的代谢作用加强了土壤中有机物质的分解，促进了植物营养元素的矿化，增强了对作物营养的供应[18]。尽管L13处理能够明显改善蓝莓根际土壤的养分状况和提高根际土壤微生物数量，但未必能完全证明它能够在蓝莓根际土壤中存活和定殖，因为其菌液中的代谢产物也有可能产生同样的效果。因此，有必要对L13在蓝莓根际土壤中的存活和定殖规律、促进蓝莓根际土壤养分活化及生物性状的作用机理进一步探讨。
参考文献：
[1]VermaJP，YadavJ，TiwariKN，etal.Impactofplantgrowthpromotingrhizobacteriaoncropproduction[J].InternationalJournalofAgriculturalResearch，2010，5：954-983.
[2]WeyensN，LelieDVD，TaghaviS，etal.Exploitingplant-microbepartnershipstoimprovebiomassproductionandremediation[J].TrendsBiotechnol.，2009，27：591-598.
[3]荣良燕，姚拓，黄高宝，等.植物根际优良促生菌（PGPR）筛选及其接种剂部分替代化肥对玉米生长影响研究[J].干旱地区农业研究，2013，31（2）：59-65.
[4]刘方春，邢尚军，马海林，等.根际促生细菌（PGPR）对冬枣根际土壤微生物数量及细菌多样性影响[J].林业科学，2013，49（8）：75-80.
[5]刘方春，邢尚军，马海林，等.PGPR生物肥对甜樱桃（Cerasuspseudocerasus）根际土壤生物学特征的影响[J].应用与环境生物学报，2012，18（5）：722-727.
[6]KloepperJW，LeongJ，TeintzeM，etal.Enhancedplantgrowthbysiderophoresproducedbyplantgrowth-promotingrhizobacteria[J].Nature，1980，286：885-886.
[7]LiuH，WuXQ，RenJH，etal.IsolationandidentificationofphosphobacteriainpoplarrhizospherefromdifferentregionsofChina[J].Pedosphere，2011，21（1）：90-97.
[8]和阳，杨巍，刘双，等.蓝莓栽培中土壤改良的方法及作用[J].北方园艺，2010，14：46-48.
[9]AbbasiMK，SharifS，KazmiM，etal.Isolationofplantgrowthpromotingrhizobacteriafromwheatrhizosphereandtheireffectonimprovinggrowth，yieldandnutrientuptakeofplants[J].PlantBiosystems，2011，145（1）：159-168.
[10]鲍士旦.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，2000，25-108.
[11]关松荫.土壤酶及其研究方法[M].北京：农业出版社，1986，3-25.
[12]宋洪宁，杜秉海，张明岩，等.环境因素对东平湖沉积物细菌群落结构的影响[J].微生物学报，2010，50（8）：1065-1071.
[13]刘来，黄保健，孙锦，等.大棚辣椒连作土壤微生物数量、酶活性与土壤肥力的关系[J].中国土壤与肥料，2013，2：5-10.
[14]刘善江，夏雪，陈桂梅，等.土壤酶的研究进展[J].中国农学通报，2011，27（21）：1-7.
[15]杨成德，龙瑞军，陈秀蓉，等.土壤微生物功能群及其研究进展[J].土壤通报，2008，39（2）：421-425.
[16]郭文文，诸葛玉平，李建勇，等.转基因番茄栽培对土壤生物学特性的影响[J].山东农业科学，2010，3：46-50.
[17]RamosB，GarciaJAL，ProbanzaA，etal.AlterationsintherhizobacterialcommunityassociatedwithEuropeanaldergrowthwheninoculatedwithPGPRstrainBacillusucheniformis[J].EnvironmentalandExperimentalBotany，2003，49（1）：61-68.
[18]刘方春，邢尚军，马海林，等.生物肥对冬枣根际土壤微环境特征的影响[J].北京林业大学学报，2012，34（5）：100-104.