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摘 要:目的:探讨冰片对骨髓基质干细胞（BMSCs）透过血脑屏障（BBB）的影响。方法:复制脑缺血再灌注大鼠模型，将大鼠随机分为BMSCs+冰片组、BMSCs组、冰片组、模型组和正常组5个组；MCAO术后24小时， 灌服冰片30min后，以3×106 BMSCs经右颈总动脉注射入大鼠体内；分别于脑缺血再灌注后第1、14、28天检查各组大鼠的神经功能，并于实验结束时采血检测血象、肝肾功能。结果:BMSCs+冰片组和BMSCs组神经功能显著改善，而前者又优于后者；各组大鼠血象、肝肾功能都正常，主要器官组织未见肿块形成。结论:冰片能够促进BMSCs透过BBB，改善神经功能；血管内移植BMSCs未见明显的副作用。
关键词：冰片;骨髓基质干细胞;血脑屏障
中图分类号：R285.6文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）07-046-03
不少研究表明，开窍药冰片具有促进其它药物透过血脑屏障（BBB）的作用，但对于开窍药能否促进相关细胞透过BBB，目前尚未见报导。近年不少学者就骨髓基质干细胞（BMSCs）治疗神经系统疾病的相关问题进行了探讨，为研究开窍药对BMSCs透过BBB的影响，我们进行了初步的探讨，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂
CO2恒温细胞培养箱（美国力高），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），离心机（上海安亭）；754紫外线可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；SDQ-30C双极射频电凝器（上海手术器械厂）。
SD大鼠骨髓基质干细胞专用培养基，CYAGEN公司生产，批号：2803200701001；PBS，南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGB-500-1；胰蛋白酶，Invitrogen Corporation公司生产,批号1356182；青霉素钠,华北制药股份有限公司生产，批号：U0511641；硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产,批号：050506。谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒，批号200509113；谷草转氨酶（AST）测定试剂盒，批号：20050913；γ-L-谷氨酰转肽酶（γ-GT）测定试剂盒，批号：20050914。肌酐测定试剂盒，批号：20051124；尿素氮定试剂盒，批号：20051126；以上试剂由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 实验动物及分组
SD大鼠，雄性，SPF级，280-320g，40只，随机分为以下五组：（1）BMSCs+冰片组：急性脑缺血再灌注模型，以BMSCs移植和冰片治疗；（2）BMSCs组：急性脑缺血再灌注模型，以BMSCs移植治疗；（3）冰片组：急性脑缺血再灌注模型，以冰片治疗；（4）模型组：急性脑缺血再灌注模型，不作治疗；（5）正常组。另以一只4周龄雄性SD大鼠备取BMSCs。
1.3 急性脑缺血再灌注模型的建立
参照Zea longa等的方法［1］，稍作改良制成MCAO模型，方法如下：大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定。分离左颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉并挂线备用,结扎颈总动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端, 以电凝笔烧断颈外动脉,于颈外动脉近心段残端距颈内、外动脉分叉处约3mm处作一切口,从切口处将直径为0.25mm的尼龙线经颈外动脉残段插入颈内动脉。尼龙线插入颈内动脉后,于入口处轻轻结扎尼龙线与入口处颈外动脉残段,然后松开夹闭颈内动脉的动脉夹,继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤,至线插入深度约20mm,此时大脑中动脉被阻塞导致左脑缺血。此时结扎入口处,尼龙线外留约1cm,缝合皮肤。2h后轻轻抽出尼龙线,实现大脑中动脉再灌注。正常组大鼠不作任何手术处理。
1.4 MCAO模型的评估方法和入选标准
MCAO模型的评估标准采用Zea longa 5级评分法［1］。0分：无神经功能缺损症状； 1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪；2 分：中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈； 3分：重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒； 4分：不能自发行走，意识水平下降。动物入选的标准:按照Zea Longa 5级评分法，取评分为2、3、4分的动物。
1.5 BMSCs的分离、纯化、培养
将4周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5min，取出后将大鼠平放固定在无菌蜡盘上，超净台上分离股骨和胫骨，清除骨表面附着的结缔组织，以无菌PBS反复冲洗，用剪刀去除股骨近端和胫骨远端，暴露骨髓腔，去除股骨和胫骨另一端的骨骺，5号针头穿刺骨端，用无菌PBS液冲出骨髓腔中的骨髓至一无菌平皿中，注射器反复吸吹，尽量避免产生气泡，使成单细胞悬液。将细胞悬液移入预置2ml PBS的无菌离心管片，2000r/min离心10min，弃上清，SD大鼠骨髓基质干细胞专用培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养，72h后换液，去除未贴壁的造血细胞，以后每3d换液一次，每次换液均用无菌PBS洗2次，再换入新培养液，待细胞长至亚单层时，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2传代培养。
1.6 BMSCs和冰片的浓度
MCAO术后24小时，以3×106 BMSCs经右颈总动脉注射入大鼠体内。冰片按250 mg•kg-1的浓度，以1%吐温配成冰片悬浊液灌胃，于注射BMSCs前30min灌服冰片。
1.7 统计学处理
本实验所有数据均用SPSS11.5进行统计，组间两两比较均以单因素方差分析进行检验。
2 结果
2.1 各组大鼠脑缺血再灌注后第1、14、28天Longa评分
2.2 实验结束时各组大鼠血象、肝肾功能检测结果
3 讨论
开窍中药具有通关开窍、启闭回苏的作用，是治疗脑部疾病的常用药；冰片为开窍药的代表药，常作为“引药”，以增加其它药物的治疗效果，许多中成药如苏合香丸、安宫牛黄丸、冰硼散等，都有冰片的配伍应用。《本草衍义》指出冰片“独行则势弱，佐使则有功”，《本草经疏》称冰片“性善走窍，无往不达”。动物实验和离体实验表明：冰片具有促进药物透过血脑屏障的作用［2-5］。BMSCs移植治疗神经系统疾病是近年的研究热点，有研究表明血管内注射的BMSCs能够透过BBB进入脑内并转化成神经细胞［6］，但由于血脑屏障的存在，血管内注射的BMSCs透过血脑屏障的数量很有限［7，8］，难以充分发挥其治疗作用，如何调控血管内注射的BMSCs进入脑实质的数量，是BMSCs治疗神经系统疾病的关键。
开窍药能否促进BMSCs进入脑实质内，从而提高其疗效？本实验结果显示：脑缺血再灌注后28天，即BMSCs移植后27天，BMSCs组和BMSCs+冰片组Longa评分均较模型组有明显改善，而BMSCs+冰片组疗效又显著优于BMSCs组；冰片组和模型组则无显著性改变；BMSCs移植对血象、肝肾功能没有明显的损害；实验中我们也肉眼观察了心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤等器官组织，均未见明显的肿块形成。实验结果提示，血管内BMSCs移植有助于受损神经功能的恢复，而移植前灌服冰片可显著提高其疗效；短期内未见BMSCs移植明显的副作用。
参考文献：
［1］ Longa EZ, Weinstein PR,Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989,20(1):84-91.
［2］ 刘启德，梁美蓉，陈芝喜．冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响［J］．广州中医学院学报，1994，11(1)：37-40.
［3］ 王宁生，谢独，梁美蓉．冰片“佐使则有功”之实验研究［J］．中医杂志，1994，35(1)：46-47．
［4］ 孙寒静，黄天来，宓穗卿，吴伟，陈宏珪. 芎冰喷雾剂脑内药物动力学研究［J］. 中药新药与临床药理,2003,14(3):177-179.
［5］ 陈艳明，王宁生. 冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响［J］. 中国中西医结合杂志,2004,24(7):632-634.
［6］ Li Y， Chopp M， Chen J， et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice［J］. J Cereb Blood Flow Metab. 2000， 20(9):1311-1319.
［7］ Pereira RF, Halford KW, O’ Hara MD, et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(11):4857-4861.
［8］ Jieli Chen， Yi Li， Lei Wang， et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］. Stroke. 2001， 32:1005.
The Influence of Borneol on BMSCs Permeating Through
Blood-brain Barrier
Abstract: Objective: To study the influence of borneol on BMSCs permeating through blood-brain barrier.Methods: The rat model of cerebral ischemia and reperfusion was copied. Then the rats were divided into 5 groups: BMSCs+ borneol group, BMSCs group, borneol group, model group and normal group. 24h after MCAO operation, and 30min after drenching borneol, 3 106 BMSCs were injected through right common carotid artery into each rat of BMSCs+ borneol group and BMSCs group. The nerve function was tested respectively in the 1st, 14th and 28th day after cerebral ischemia and reperfusion. At the experiment endpoint, the level of blood RBC, WBC, PL were examined, and lever and renal function were tested. Results: The nerve function of BMSCs+ borneol group and BMSCs group were improved significantly. While the former was better than the latter. The level of blood RBC, WBC and PL, and the lever and renal function in all groups were normal. No lump was founded in all rats. Conclusions: Borneol can promote BMSCs permeating through BBB to improve nerve function. No visible side-effect was founded in intravascular BMSCs-transplanting rats.
Key words:Borneol; Bone matrix stem cell; Blood-brain barrier
关键词：冰片;骨髓基质干细胞;血脑屏障
中图分类号：R285.6文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）07-046-03
不少研究表明，开窍药冰片具有促进其它药物透过血脑屏障（BBB）的作用，但对于开窍药能否促进相关细胞透过BBB，目前尚未见报导。近年不少学者就骨髓基质干细胞（BMSCs）治疗神经系统疾病的相关问题进行了探讨，为研究开窍药对BMSCs透过BBB的影响，我们进行了初步的探讨，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂
CO2恒温细胞培养箱（美国力高），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），离心机（上海安亭）；754紫外线可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；SDQ-30C双极射频电凝器（上海手术器械厂）。
SD大鼠骨髓基质干细胞专用培养基，CYAGEN公司生产，批号：2803200701001；PBS，南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGB-500-1；胰蛋白酶，Invitrogen Corporation公司生产,批号1356182；青霉素钠,华北制药股份有限公司生产，批号：U0511641；硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产,批号：050506。谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒，批号200509113；谷草转氨酶（AST）测定试剂盒，批号：20050913；γ-L-谷氨酰转肽酶（γ-GT）测定试剂盒，批号：20050914。肌酐测定试剂盒，批号：20051124；尿素氮定试剂盒，批号：20051126；以上试剂由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 实验动物及分组
SD大鼠，雄性，SPF级，280-320g，40只，随机分为以下五组：（1）BMSCs+冰片组：急性脑缺血再灌注模型，以BMSCs移植和冰片治疗；（2）BMSCs组：急性脑缺血再灌注模型，以BMSCs移植治疗；（3）冰片组：急性脑缺血再灌注模型，以冰片治疗；（4）模型组：急性脑缺血再灌注模型，不作治疗；（5）正常组。另以一只4周龄雄性SD大鼠备取BMSCs。
1.3 急性脑缺血再灌注模型的建立
参照Zea longa等的方法［1］，稍作改良制成MCAO模型，方法如下：大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定。分离左颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉并挂线备用,结扎颈总动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端, 以电凝笔烧断颈外动脉,于颈外动脉近心段残端距颈内、外动脉分叉处约3mm处作一切口,从切口处将直径为0.25mm的尼龙线经颈外动脉残段插入颈内动脉。尼龙线插入颈内动脉后,于入口处轻轻结扎尼龙线与入口处颈外动脉残段,然后松开夹闭颈内动脉的动脉夹,继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤,至线插入深度约20mm,此时大脑中动脉被阻塞导致左脑缺血。此时结扎入口处,尼龙线外留约1cm,缝合皮肤。2h后轻轻抽出尼龙线,实现大脑中动脉再灌注。正常组大鼠不作任何手术处理。
1.4 MCAO模型的评估方法和入选标准
MCAO模型的评估标准采用Zea longa 5级评分法［1］。0分：无神经功能缺损症状； 1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪；2 分：中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈； 3分：重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒； 4分：不能自发行走，意识水平下降。动物入选的标准:按照Zea Longa 5级评分法，取评分为2、3、4分的动物。
1.5 BMSCs的分离、纯化、培养
将4周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5min，取出后将大鼠平放固定在无菌蜡盘上，超净台上分离股骨和胫骨，清除骨表面附着的结缔组织，以无菌PBS反复冲洗，用剪刀去除股骨近端和胫骨远端，暴露骨髓腔，去除股骨和胫骨另一端的骨骺，5号针头穿刺骨端，用无菌PBS液冲出骨髓腔中的骨髓至一无菌平皿中，注射器反复吸吹，尽量避免产生气泡，使成单细胞悬液。将细胞悬液移入预置2ml PBS的无菌离心管片，2000r/min离心10min，弃上清，SD大鼠骨髓基质干细胞专用培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养，72h后换液，去除未贴壁的造血细胞，以后每3d换液一次，每次换液均用无菌PBS洗2次，再换入新培养液，待细胞长至亚单层时，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2传代培养。
1.6 BMSCs和冰片的浓度
MCAO术后24小时，以3×106 BMSCs经右颈总动脉注射入大鼠体内。冰片按250 mg•kg-1的浓度，以1%吐温配成冰片悬浊液灌胃，于注射BMSCs前30min灌服冰片。
1.7 统计学处理
本实验所有数据均用SPSS11.5进行统计，组间两两比较均以单因素方差分析进行检验。
2 结果
2.1 各组大鼠脑缺血再灌注后第1、14、28天Longa评分
2.2 实验结束时各组大鼠血象、肝肾功能检测结果
3 讨论
开窍中药具有通关开窍、启闭回苏的作用，是治疗脑部疾病的常用药；冰片为开窍药的代表药，常作为“引药”，以增加其它药物的治疗效果，许多中成药如苏合香丸、安宫牛黄丸、冰硼散等，都有冰片的配伍应用。《本草衍义》指出冰片“独行则势弱，佐使则有功”，《本草经疏》称冰片“性善走窍，无往不达”。动物实验和离体实验表明：冰片具有促进药物透过血脑屏障的作用［2-5］。BMSCs移植治疗神经系统疾病是近年的研究热点，有研究表明血管内注射的BMSCs能够透过BBB进入脑内并转化成神经细胞［6］，但由于血脑屏障的存在，血管内注射的BMSCs透过血脑屏障的数量很有限［7，8］，难以充分发挥其治疗作用，如何调控血管内注射的BMSCs进入脑实质的数量，是BMSCs治疗神经系统疾病的关键。
开窍药能否促进BMSCs进入脑实质内，从而提高其疗效？本实验结果显示：脑缺血再灌注后28天，即BMSCs移植后27天，BMSCs组和BMSCs+冰片组Longa评分均较模型组有明显改善，而BMSCs+冰片组疗效又显著优于BMSCs组；冰片组和模型组则无显著性改变；BMSCs移植对血象、肝肾功能没有明显的损害；实验中我们也肉眼观察了心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤等器官组织，均未见明显的肿块形成。实验结果提示，血管内BMSCs移植有助于受损神经功能的恢复，而移植前灌服冰片可显著提高其疗效；短期内未见BMSCs移植明显的副作用。
参考文献：
［1］ Longa EZ, Weinstein PR,Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989,20(1):84-91.
［2］ 刘启德，梁美蓉，陈芝喜．冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响［J］．广州中医学院学报，1994，11(1)：37-40.
［3］ 王宁生，谢独，梁美蓉．冰片“佐使则有功”之实验研究［J］．中医杂志，1994，35(1)：46-47．
［4］ 孙寒静，黄天来，宓穗卿，吴伟，陈宏珪. 芎冰喷雾剂脑内药物动力学研究［J］. 中药新药与临床药理,2003,14(3):177-179.
［5］ 陈艳明，王宁生. 冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响［J］. 中国中西医结合杂志,2004,24(7):632-634.
［6］ Li Y， Chopp M， Chen J， et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice［J］. J Cereb Blood Flow Metab. 2000， 20(9):1311-1319.
［7］ Pereira RF, Halford KW, O’ Hara MD, et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(11):4857-4861.
［8］ Jieli Chen， Yi Li， Lei Wang， et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］. Stroke. 2001， 32:1005.
The Influence of Borneol on BMSCs Permeating Through
Blood-brain Barrier
Abstract: Objective: To study the influence of borneol on BMSCs permeating through blood-brain barrier.Methods: The rat model of cerebral ischemia and reperfusion was copied. Then the rats were divided into 5 groups: BMSCs+ borneol group, BMSCs group, borneol group, model group and normal group. 24h after MCAO operation, and 30min after drenching borneol, 3 106 BMSCs were injected through right common carotid artery into each rat of BMSCs+ borneol group and BMSCs group. The nerve function was tested respectively in the 1st, 14th and 28th day after cerebral ischemia and reperfusion. At the experiment endpoint, the level of blood RBC, WBC, PL were examined, and lever and renal function were tested. Results: The nerve function of BMSCs+ borneol group and BMSCs group were improved significantly. While the former was better than the latter. The level of blood RBC, WBC and PL, and the lever and renal function in all groups were normal. No lump was founded in all rats. Conclusions: Borneol can promote BMSCs permeating through BBB to improve nerve function. No visible side-effect was founded in intravascular BMSCs-transplanting rats.
Key words:Borneol; Bone matrix stem cell; Blood-brain barrier