【摘 要】
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目的:构建和表达HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体.方法:利用重叠延伸PCR将HBc 18-27、(Gly4Ser)3、β2m、(Gly4 Ser)4和HLA-A*0201胞外区依次串联为单链三聚体(single-
【机 构】
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东南大学医学院病原生物学与免疫学系,江苏南京,210009
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目的:构建和表达HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体.方法:利用重叠延伸PCR将HBc 18-27、(Gly4Ser)3、β2m、(Gly4 Ser)4和HLA-A*0201胞外区依次串联为单链三聚体(single-chain trimer,SCT)融合基因,通过同源重组克隆技术插入到pET28a原核表达载体,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,采用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,通过稀释复性法折叠成HLA-A*0201/HBc18-27的复合单体,并生物素化,将单体包被到直径4.5 μm的磁性微球,用构象特异性单抗(W6/32)进行荧光染色,流式细胞术分析其空间构象.结果:pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27基因序列和蛋白大小与预测一致;纯化后融合蛋白纯度约93％;流式细胞术分析显示pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27单体具有正确的空间构象.结论:利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术成功制备了HLA-A* 0201/HBc18-27的单链复合体,无需限制性内切酶和连接酶,发展了主要组织相容性单链复合体技术,有效简化了pMHC Ⅰ类分子的制备过程.
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