评价大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤时10-11易位蛋白3(TET3)诱导DNA去甲基化在甲烷上调核转录因子E2相关因子2(Nrf2)表达中的作用。
方法原代培养大鼠脊髓神经元，以1×105个/ml密度接种于6孔板，采用随机数字表法分为5组(n＝48)：正常对照组(C组)、氧糖缺失-复氧复糖组(OGD/R组)、甲烷组(M组)、甲烷＋TET3-siRNA组(M＋siTET3组)和甲烷＋阴性siRNA组(M＋siCon组)。采用无糖-无血清Earle平衡盐液，在5%CO2-95%N2缺氧培养箱中孵育2 h ，然后正常培养的方法制备氧糖缺失-复氧复糖损伤模型。M组于复氧复糖时在培养液中加入200 μl甲烷饱和生理盐水(甲烷终浓度1.8 mmol/L)；M＋siTET3组和M＋siCon组于复氧复糖前24 h时分别加入100 pmol/L TET3-siRNA和100 pmol/L阴性siRNA进行转染。复氧复糖12 h时，测定神经元存活率、LDH漏出率、神经元凋亡率，采用实时荧光定量PCR法检测TET3和Nrf2的mRNA表达，采用Western blot法测定核蛋白Nrf2和TET3表达水平；采用ELISA法测定神经元SOD、过氧化氢酶(CAT)和MDA含量。提取神经元DNA，采用ELISA法确定DNA甲基化率、羟甲基化率，采用实时荧光甲基化特异性PCR法检测Nrf2基因启动子CpG岛甲基化水平。
结果与C组比较，OGD/R组神经元存活率降低，LDH释放率和凋亡率升高(P<0.01)；与OGD/R组比较，M组神经元存活率升高，LDH释放率和凋亡率降低，TET3及其mRNA、Nrf2及其mRNA表达上调，DNA羟甲基化率、SOD和CAT含量升高，DNA及Nrf2启动子甲基化率、MDA含量降低(P<0.05或0.01)；与M组比较，M＋siTET3组神经元存活率降低，LDH释放率和凋亡率升高，TET3及其mRNA、Nrf2及其mRNA表达下调，DNA羟甲基化率、SOD和CAT含量降低，DNA及Nrf2启动子甲基化率、MDA含量升高(P<0.05或0.01)，M＋siCon组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。
结论大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤时甲烷上调Nrf2表达的机制与激活TET3，促进Nrf2启动子区DNA去甲基化有关。