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摘要：目的 建立超高效液相-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定家兔血浆中白头翁皂苷B4（AB4）浓度，并初步研究其在家兔体内的药动学。方法 4只家兔随机分组，自身对照分别给予AB4片剂及注射液，不同时间点采血，UPLC-MS/MS法测定血浆药物浓度，采用DAS 3.0软件计算主要药动学参数。结果 AB4片剂及注射液给药后的t1/2分别为（16.24±5.50）、（2.43±0.62）h，AUC0-24分别为（0.38±0.09）、（11.35±4.76）mg×h·L-1。结论 AB4口服给药绝对生物利用度很低，约为3.35 %。
关键词：白头翁皂苷B4;UPLC-MS/MS法;血药浓度;生物利用度
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2018）06-151-02
白头翁为毛莨科植物白头翁 Pulsatilla chinensis （ Bunge ）Regel 的干燥根，始载于《神农本草经》。味苦性寒，专入大肠经。具有清热解毒、凉血止痢的功效0。AB4是白头翁药材的质控指标性成分。
本实验建立了UPLC-MS/MS法测定AB4在家兔体内的血药浓度，并初步比较了两种剂型的药动学特征，以期为AB4 的剂型开发及临床应用提供依据。
1 材料
1.1 仪器 Xevo TQ-S 超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪（美国Waters 公司），配备电喷雾电离源（ESI）; Atiantis UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 ?m，美国Waters 公司）;VDRTEX-6涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;TGL-16台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司公司）。
1.2 藥品与试剂 AB4原料药（由苏州本草天成生物技术有限公司提供，纯度95%以上），AB4对照品（批号：111766-200601，中国药品生物制品检定所）;白头翁皂苷B5（HSC）对照品（由苏州本草天成生物技术有限公司提供，纯度99%以上）;甲醇、乙腈（LC-MS，沃凯）。
1.3 动物 新西兰兔4只（约2 kg），购于苏州大学实验动物中心。
2 实验方法
2.1 分析方法
2.1.1 溶液配制 分别精密称取AB4、HSC对照品10.2、10.21 mg溶于甲醇分别配制成浓度为1.020、1.021 mg/mL的AB4标准储备液及HSC内标贮备液。用甲醇稀释上述贮备液，分别得4.08、2.04、0.408、0.204、0.102、0.0408、0.0204、0.00408 μg·mL-1，AB4标准溶液和4.084 μg·mL-1，0.4084 μg·mL-1的HSC内标溶液以及0.00408，0.408，4.08μg·mL-1系列 QC 样品溶液，于 4 ℃冰箱保存，备用。
2.1.2 血浆样品处理 取血浆50 μL置于离心管内，加入0.1 mol·L-1 的NaOH 10 μL，旋涡1 min，加浓度为0.4084 μg·mL-1的内标HSC甲醇溶液（静脉注射为4.084 μg·mL-1）100 μL，旋涡1 min，加甲醇850 μL，涡旋1 min，13000 r/min（4 ℃）离心10 min后，取出上清液UPLC-MS/MS进样0。
2.2 药动学实验方法
2.2.1 AB4片剂制备 精密称AB4原料药及MCC适量，研磨混合，过80目筛，测定药物含量，按所需药量压片，备用。
2.2.2 AB4注射液制备 精密称AB4原料药适量，加入一定量生理盐水，配制溶液浓度为12.3 mg/mL的注射液。
2.2.3 血浆样品采集 4只家兔随机分为两组，每组2只，分别按1.85 mg·kg-1的剂量给予AB4片剂和注射液，自身对照交叉给药，给药前及给药后0.08（仅静脉注射）、0.17、0.25（仅静脉注射）、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12、16（仅口服）、24 h耳缘静脉取血，置于肝素化EP管内，3500 r·min-1（4 ℃）离心10 min，取血浆于-20℃条件下保存备用。
2.2.4 药动学数据处理及分析 将所得的血药浓度-时间数据代入DAS 3.0程序进行分析，计算主要的药动学参数半衰期t1/2，达峰浓度Cmax，曲线下面积AUC0～24，AUC0～∞及绝对生物利用度F。
绝对生物利用度计算公式为：
F =AUC（oral） / AUC（iv）× 100%
3 实验结果
3.1 方法学考察 含AB4药物血浆样品，于-20 ℃条件下冷冻保存，分别于0、1、2、3天时取样50 ?L，按“2.1.2 血浆样品处理”项下操作后进样测定，测得RSD=8.78 %（< 15 %），说明在-20 ℃条件下存放3天血浆冷冻稳定性较好。
取部分含AB4药物血浆样品，常温条件下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h取样50 ?L，按“2.1.2 血浆样品处理”项下操作后进样测定，计算样品中药物浓度变化，测得RSD=9.11 %（< 15 %），说明血浆在常温条件下12 h内稳定性较好。
血浆样品的提取液常温条件下放置，分别于0、2、6、10、16 h测定，计算浓度变化，测得RSD=4.25 %（< 15 %），说明血浆样品提取液在常温条件下16 h内稳定性较好。
3.2 体内药动学研究 各时间点血浆样品，按“2.1.2 血浆样品处理”项方法处理和测定，代入随行标曲计算得AB4浓度，绘制平均血药浓度-时间曲线（见图1），血药浓度-时间数据代入DAS 3.0程序计算其药动学参数。
4 討论
本实验建立了UPLC-MS/MS测定家兔体内AB4的方法，具有专属性强、灵敏度高、分析速度快等优点。采用DAS 3.0程序对血药浓度-时间数据进行拟合，AB4在家兔体内代谢符合二相房室模型，其片剂及注射液给药后的t1/2分别为（16.24±5.50）、（2.43±0.62）h，AUC0-24分别为（0.38±0.09）、（11.35±4.76）mg×h·L-1。
本实验结果表明AB4口服片剂的绝对生物利用度仅3.35 %左右，也验证了上述推论。也有文献报道AB4受肝脏首过效应代谢达27 %0，导致进入体循环的药量减少，进一步验证了上述结果。
实验发现，AB4口服给药的药时曲线呈现双峰现象，可能与其体内代谢及肠肝循环有关，有待进一步研究验证。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[M]. 北京：化学工业出版社，2015.
[2]仝新勇，周建平，谭燕，林文. LC-MS/MS研究紫杉醇自组装前体脂质体在大鼠体内的组织分布及靶向性[J]. 中国药科大学学报.，2006，37（4）：318-322.
[3]Chunyun Chen， Lianwen Qi， Ling Yi， et al. Liquid chromatography–mass spectrometry analysis of macranthoidin B， macranthoidin A， dipsacoside B， and macranthoside B in rat plasma for the pharmacokinetic investigation[J]. Journal of Chromatography B， 2009，877（3）：159-165.
关键词：白头翁皂苷B4;UPLC-MS/MS法;血药浓度;生物利用度
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2018）06-151-02
白头翁为毛莨科植物白头翁 Pulsatilla chinensis （ Bunge ）Regel 的干燥根，始载于《神农本草经》。味苦性寒，专入大肠经。具有清热解毒、凉血止痢的功效0。AB4是白头翁药材的质控指标性成分。
本实验建立了UPLC-MS/MS法测定AB4在家兔体内的血药浓度，并初步比较了两种剂型的药动学特征，以期为AB4 的剂型开发及临床应用提供依据。
1 材料
1.1 仪器 Xevo TQ-S 超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪（美国Waters 公司），配备电喷雾电离源（ESI）; Atiantis UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 ?m，美国Waters 公司）;VDRTEX-6涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;TGL-16台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司公司）。
1.2 藥品与试剂 AB4原料药（由苏州本草天成生物技术有限公司提供，纯度95%以上），AB4对照品（批号：111766-200601，中国药品生物制品检定所）;白头翁皂苷B5（HSC）对照品（由苏州本草天成生物技术有限公司提供，纯度99%以上）;甲醇、乙腈（LC-MS，沃凯）。
1.3 动物 新西兰兔4只（约2 kg），购于苏州大学实验动物中心。
2 实验方法
2.1 分析方法
2.1.1 溶液配制 分别精密称取AB4、HSC对照品10.2、10.21 mg溶于甲醇分别配制成浓度为1.020、1.021 mg/mL的AB4标准储备液及HSC内标贮备液。用甲醇稀释上述贮备液，分别得4.08、2.04、0.408、0.204、0.102、0.0408、0.0204、0.00408 μg·mL-1，AB4标准溶液和4.084 μg·mL-1，0.4084 μg·mL-1的HSC内标溶液以及0.00408，0.408，4.08μg·mL-1系列 QC 样品溶液，于 4 ℃冰箱保存，备用。
2.1.2 血浆样品处理 取血浆50 μL置于离心管内，加入0.1 mol·L-1 的NaOH 10 μL，旋涡1 min，加浓度为0.4084 μg·mL-1的内标HSC甲醇溶液（静脉注射为4.084 μg·mL-1）100 μL，旋涡1 min，加甲醇850 μL，涡旋1 min，13000 r/min（4 ℃）离心10 min后，取出上清液UPLC-MS/MS进样0。
2.2 药动学实验方法
2.2.1 AB4片剂制备 精密称AB4原料药及MCC适量，研磨混合，过80目筛，测定药物含量，按所需药量压片，备用。
2.2.2 AB4注射液制备 精密称AB4原料药适量，加入一定量生理盐水，配制溶液浓度为12.3 mg/mL的注射液。
2.2.3 血浆样品采集 4只家兔随机分为两组，每组2只，分别按1.85 mg·kg-1的剂量给予AB4片剂和注射液，自身对照交叉给药，给药前及给药后0.08（仅静脉注射）、0.17、0.25（仅静脉注射）、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12、16（仅口服）、24 h耳缘静脉取血，置于肝素化EP管内，3500 r·min-1（4 ℃）离心10 min，取血浆于-20℃条件下保存备用。
2.2.4 药动学数据处理及分析 将所得的血药浓度-时间数据代入DAS 3.0程序进行分析，计算主要的药动学参数半衰期t1/2，达峰浓度Cmax，曲线下面积AUC0～24，AUC0～∞及绝对生物利用度F。
绝对生物利用度计算公式为：
F =AUC（oral） / AUC（iv）× 100%
3 实验结果
3.1 方法学考察 含AB4药物血浆样品，于-20 ℃条件下冷冻保存，分别于0、1、2、3天时取样50 ?L，按“2.1.2 血浆样品处理”项下操作后进样测定，测得RSD=8.78 %（< 15 %），说明在-20 ℃条件下存放3天血浆冷冻稳定性较好。
取部分含AB4药物血浆样品，常温条件下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h取样50 ?L，按“2.1.2 血浆样品处理”项下操作后进样测定，计算样品中药物浓度变化，测得RSD=9.11 %（< 15 %），说明血浆在常温条件下12 h内稳定性较好。
血浆样品的提取液常温条件下放置，分别于0、2、6、10、16 h测定，计算浓度变化，测得RSD=4.25 %（< 15 %），说明血浆样品提取液在常温条件下16 h内稳定性较好。
3.2 体内药动学研究 各时间点血浆样品，按“2.1.2 血浆样品处理”项方法处理和测定，代入随行标曲计算得AB4浓度，绘制平均血药浓度-时间曲线（见图1），血药浓度-时间数据代入DAS 3.0程序计算其药动学参数。
4 討论
本实验建立了UPLC-MS/MS测定家兔体内AB4的方法，具有专属性强、灵敏度高、分析速度快等优点。采用DAS 3.0程序对血药浓度-时间数据进行拟合，AB4在家兔体内代谢符合二相房室模型，其片剂及注射液给药后的t1/2分别为（16.24±5.50）、（2.43±0.62）h，AUC0-24分别为（0.38±0.09）、（11.35±4.76）mg×h·L-1。
本实验结果表明AB4口服片剂的绝对生物利用度仅3.35 %左右，也验证了上述推论。也有文献报道AB4受肝脏首过效应代谢达27 %0，导致进入体循环的药量减少，进一步验证了上述结果。
实验发现，AB4口服给药的药时曲线呈现双峰现象，可能与其体内代谢及肠肝循环有关，有待进一步研究验证。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[M]. 北京：化学工业出版社，2015.
[2]仝新勇，周建平，谭燕，林文. LC-MS/MS研究紫杉醇自组装前体脂质体在大鼠体内的组织分布及靶向性[J]. 中国药科大学学报.，2006，37（4）：318-322.
[3]Chunyun Chen， Lianwen Qi， Ling Yi， et al. Liquid chromatography–mass spectrometry analysis of macranthoidin B， macranthoidin A， dipsacoside B， and macranthoside B in rat plasma for the pharmacokinetic investigation[J]. Journal of Chromatography B， 2009，877（3）：159-165.