论文部分内容阅读
［摘 要］ 目的 研究HIF_1对大鼠急性缺血心肌的保护作用及其作 用机制。方法 应用HIF_1活性诱导剂氯化钴预处理大鼠，观察预处理对大 鼠急性心肌梗死面积和心肌VEGF、iNOS蛋白表达的影响。结果 氯化钴预 处理组大鼠较对照组和假手术组急性心肌梗死面积显著减少(P＜0.01)，VEGF、iNOS蛋 白表达显著增高(P＜0.01)。结论 HIF_1可以减少大鼠急性心肌梗死 面积，对大鼠急性缺血心肌具有保护作用，其机制可能与HIF_1促进VEGF、iNOS蛋白表达增 加有关。
［关键词］ 缺氧诱导因子_1；心肌保护；急性缺血；大鼠
中图分类号：R542.2 文献标识 码：A 文章编号：1009_816X(2007)04_0236_03
The Myocardial Protection Induced by Hypoxia_inducible Factor 1 on Ac ute Myocardial Ischemia in Rats. LI Xing-hai, ZHU Bing, WANG Ning-fu, Hangzhou First People's Hospital, Zhejiang 310006, China
［Abstract］ Objective To study the myocardial protetion of hypo xia_inducible factor 1 (HIF_1) on acute myocardial is chemia in rats. Me th ods Healthy 3_week_old rats were used in experiments. Acute myocardial i schemia was induced by ligating one branch of arteria coronaria sinistra. Acute myocardial ischemia infarct size was determined by the weight of necrosis myocar dium/left ventricle heart. Immunohistochemical method was used to show the expre ssion of VEGF and iNOS in myocardium. Results Cobalt chloride is one of HIF_1 active inducers. Compared with control group, the infarct size in cobalt chloride pretreated group was significantly reduced (P＜0.01), and t he expression of VEGF and iNOS in myocardium was significantly increased (P ＜0.01). Conclusions HIF_1 can reduce the acute myocardium infa rct size of rats. The protection perhaps is due to the promotion of HIF_1 on VEG F and iNOS in the myocardium.
［Key words］ Hypoxia_inducible factor 1; Myocardium protection; Acute myocardial ischemia; Rats
缺氧诱导因子_1(hypoxia_inducible factor 1, HIF_1)是哺乳动物组织细胞在缺氧/缺血条 件下产生的一种bHLH核转录因子，可以促进其下游缺氧反应基因，如血管内皮生长因子(vas cular endothelial growth factor, VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxid e synthase, iNOS)，促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)等的表达，增强组织细胞抵抗缺血缺氧的能力［1，2］。本 实验应用HIF_1活性诱导剂氯化钴预处理大鼠，预测预处理对大鼠急性心肌梗死面积和VEGF 、iNOS蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料：
(1)健康雄性3周龄SD大鼠18只，体重40～60g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心 。
(2)HIF_1α、iNOS和VEGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP_9002免疫组化试剂盒(美 国ZYMED公司)购自北京中山生物技术有限公司。氯化钴(CoCl2•6H2O)，北京红星化工 厂生产。用蒸馏水配成0.6% CoCl2溶液备用。红四氮唑(TTC)由上海第三试剂厂生产(批 号970924)，用前以0.1M.PH7.4的PBS缓冲液配成1%溶液。
（3) DH-150型小动物呼吸机，浙江医科大学医学仪器实验厂生产。Power Lab/16sp信号处 理器、生物放大器均为澳大利亚AD Instrument公司产品；联想电脑。CS501型超级恒温水浴 器，南通科学仪器厂生产。Mettler Toledo电子分析天平（型号PL303,精确度：0.001g)。
(4)图象分析软件采用华中科技大学同济医学院病理科HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文 分析系统。
1.2 方法：
（1)将试验大鼠随机分为三组：假手术组(F组，n=6)、对照组(C组，n=6)和实验组（H组，n =6）。假手术组和对照组给予腹腔注射蒸馏水（1ml/100g），回笼普通饲养24h。实验组给 予腹腔注射0.6%CoCl2溶液（60mg/kg),回笼普通饲养24h。
假手术组预处理24h后，给予3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，气管插管后接DH_150 型小动物呼吸机，按1ml/100g潮气量，60～70次／分的频率给予呼气末持续正压呼吸，呼： 吸比为2：1。从胸骨左缘3、4肋间进胸，暴露胸腔、破心包，暴露肺动脉圆锥与左心耳根部 间的左冠状静脉。以左冠状静脉为标志，用3/8圆3×10不锈钢圆针，3-0丝线在左冠状动脉 前降支下缝一针，丝线不打结。稳定约5分钟后逐层关胸。回笼普通普通饲养24h。
对照组和实验组预处理24h后，按上述同样方法，用3～0丝线在左冠状动脉前降支下缝一针 并 稳定5min后将丝线打结，以左室前壁紫绀或称蓝紫色及同步心电图示S_T段抬高、QRS幅度升 高为结扎成功标志。稳定约5分钟后逐层关胸。回笼普通普通饲养24h。
(2）检测指标：免疫组化法检测SD大鼠幼鼠心肌中HIF_1α、iNOS、VEGF的表达。以阳性染 色 面积百分比（％）显示。心梗面积测定：手术24h后，3组幼鼠均给予3%戊巴比妥钠腹腔注射 （50mg/kg）麻醉。迅速开胸取下心脏，用0.1M.pH 7.4的PBS缓冲液冲洗心脏两次，用吸 水纸吸干心脏表面PBS缓冲液，剔除心脏的心房和右室后，将左室置于-20℃冰箱。冷冻5min 后将心脏取出，平行房室沟将左室切成1.5～2mm厚共5～6片。置预温37℃、1%TTC磷酸缓冲 液 中染色约10min。坏死心肌呈白色，未坏死心肌呈红色。待色差明显后取出左室断面，置10% 甲醛溶液中固定1h。分离左室染色部分，分析天平称重，计算坏死区／左室重量百分比。同 时取部分未坏死心肌作免疫组化检测。
免疫组化检测及判断：24小时内将心脏标本常规石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水进行免疫组化 染色。
免疫组化染色步骤按试剂盒说明进行。
阳性结果判断：胞核或胞浆呈棕色颗粒染色。
定量分析：HPIAS_1000型高清晰度彩色病理图文分析系统对免疫组化切片进行图象扫描和分 析，定量计算阳性染色面积百分比。
(3)实验动物淘汰标准：术中出血超过2ml者；做手术模型过程中心率低于240次／分者；呼 吸、心跳停止超过30秒者；TTC染色，称重法检测坏死区／左室重量小于15%者。
符合上面任意一条或一条以上标准者，被淘汰出实验。随机选择另外符合要求的动物补充， 保证每组实验动物例数为6例。
1.3 统计方法：计量资料以均数士标准差（x±s）表示，组间比较用SPSS10.0软件中Least_significant difference(LSD)法检 验，P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 实验组(H组)大鼠心肌内HIF_1α、iNOS和VEGF表达量与对照组(C组)3相比明显增加 (P＜0.01)。实验组(H组)与假手术组(F组)比较无显著差异(P＞0.05)，见表1 。
2.2 实验组(H组)大鼠心梗面积与对照组(C组)相比明显减小(P＜0.01)。假手术组(F 组)大鼠心梗面积为0，见表2。
3 讨论
HIF_I是在缺血／缺氧条件下哺乳动物组织细胞产生的一种bHLH核转录因子［1,2］。HIF_1以异源二聚体形式存在，包括HIF_1α和HIF_1β两个亚基。HIF_1α是HIF_1的活性亚 基和氧调节亚基［2］，其结构中包含反式活化结构域(trans_activation domain, T AD）和氧依赖降解结构域(oxygen dependent degradation domain, ODD)前者参与转录活化 ，后者控制其常氧环境中的降解［3］。低氧／缺血／氯化钴可抑制HIF_1α蛋白降解 ，使细胞内HIF_1α蛋白迅速积累并转入核内与HIF_1β蛋白结合，形成具有转录活性的二聚 体［3］。HIF_1所调控靶基因的启动子或增强子中必须包含低氧反应元件(HRE），其 核心序列为5’_TACGTGCT_3’,而且其中必须有一个或一个以上的HIF_1结合位点。HIF_1通 过促进其下游缺氧反应基因，如VEGF、iNOS、EPO、GLUT1等的表达，广泛参与组织细胞的缺 氧反应和缺氧适应性反应，并在此过程中起关键作用［4］。
iNOS是HIF_1的潜在靶基因，HIF_1通过结合iNOS基因5’端的低氧反应元件(HRE）序列而诱 导缺氧心肌内iNOS的基因表达，而且可介导IL_1β对iNOS基因和蛋白表达诱导放大作用 ［5］。iNOS产生于心肌细胞、血管平滑肌细胞和吞噬细胞，仅在被激活后表达，增加NO 的产生。iNOS一旦表达，将与CaM牢固结合，并维持在最大活性状态，其合成的NO能持续相 对较长时间（数小时至数天）。NO属于血管内皮衍生性舒张因子(EDRF),是心血管系统最重 要的调节因子之一［6-8］。NO可以调节冠脉循环和心肌功能；扩张冠脉血管，抑制 血小板聚集和白细胞粘附。国内外大量研究表明，iNOS在心肌预处理的心肌保护作用中 扮演着扳机和介质的双重角色［9］。本实验结果表明，氯化钻预处理后大鼠心肌内i NOS蛋白表达增加，提示HIF_1可能通过增加在体心肌内iNOS蛋白表达对急性缺血心肌起到保 护作用。
VEGF编码基因是HIF_1转录活化的靶基因，在VEGF 5’端增强子内存在HRE,且包含有HIF_1的 结合位点，HIF_1可与VEGF 5'端增强子结合使VEGF的转录和表达增强。VEGF是内皮细胞特异 性的促有丝分裂原，其主要生物学功能是促进内皮细胞增殖、新生血管形成和增加血管通透 性［10，11］。本实验结果表明，氯化钻预处理后大鼠心肌内VEGF蛋白 表达增加，提示增加心肌内VEGF蛋白表达可能是HIF_1对在体急性缺血心肌的保护作用机制 之一。
综上所述，HIF_1可减少大鼠在体急性心肌梗死面积，对大鼠急性缺血心肌具有保护作用， 其机制可能与HIF_1促进心肌内iNOS和VEGF蛋白表达增加有关。HIF_1有可能成为心肌保护和 缺血性心脏病治疗的新靶点。
参考文献
［1］Wang GL, Jiang BH, Rue EA, et al. Hypoxia_inducible factor 1 is a b asic_helix_loop_helix_PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension［J］．Pro c Natl Acad Sci U S A，1995，92（12）：5510-5514．
［2］Jiang BH，Rue E，Wang GL, et al．Dimerization, DNA binding, and transactiva tion properties of hypoxia-inducible factor 1［J］．Biol Chem, 1996，271（30）： 17771-17778．
［3］Jiang BH，Zheng JZ，Leung SW, et al．Transactivation and inhibitory domains of hypoxia_inducible factor l alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension［J］．J Biol Chem，1997，272（31）：19253-19260．
［4］Bracken CP，Whitelaw ML, Peet DJ．The hypoxia- inducible factors：key trans criptional regulators of hypoxic responses［J］．Cell Mol Life Sci，2003，60(7） ：1376-1393．
［5］Jung F，Palmer LA，Zhou N, et al．Hypoxic regulation of inducible nitric ox ide synthase via hypoxia indu_cible factor_1 in cardiac myocytes［J］．Circ Res ，2000，86（3）：319-325．
［6］Jugdutt BI．Nitric oxide and cardiovascular protect_tion［J］．Heart Fail R ev, 2003，8（1）：29-34．
［7］Llorens S，Jordan J，Nava E．The nitric oxide pathway in the cardiovascular system［J］．J Physiol Biochem，2002，58(3）：179-188．
［8］Morbidelli L, Donnini S，Ziche M．Role of nitric oxide in the modulation of angiogenesis［J］．Curr Pharm Des，2003，9(7)：521-530．
［9］Xi L，Tekin D，Gursoy E, et al．Evidence that NOS2 acts as a trigger and me diator of late preconditioning induced by acute systemic hypoxia［J］．Am J Phys iol Heart Circ Physiol，2002，283（1）：H5-12．
［10］Ferrara N．Molecular and biological properties of vascular endothelial gro wth factor［J］．J Mol Med，1999，77（7）：527-543．
［11］Drake CJ，Little CD．VEGF and vascular fusion：impli_cations for normal a nd pathological vessels［J］．J Histochem Cytochem，1999，47（11）：1351-1356．
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
［关键词］ 缺氧诱导因子_1；心肌保护；急性缺血；大鼠
中图分类号：R542.2 文献标识 码：A 文章编号：1009_816X(2007)04_0236_03
The Myocardial Protection Induced by Hypoxia_inducible Factor 1 on Ac ute Myocardial Ischemia in Rats. LI Xing-hai, ZHU Bing, WANG Ning-fu, Hangzhou First People's Hospital, Zhejiang 310006, China
［Abstract］ Objective To study the myocardial protetion of hypo xia_inducible factor 1 (HIF_1) on acute myocardial is chemia in rats. Me th ods Healthy 3_week_old rats were used in experiments. Acute myocardial i schemia was induced by ligating one branch of arteria coronaria sinistra. Acute myocardial ischemia infarct size was determined by the weight of necrosis myocar dium/left ventricle heart. Immunohistochemical method was used to show the expre ssion of VEGF and iNOS in myocardium. Results Cobalt chloride is one of HIF_1 active inducers. Compared with control group, the infarct size in cobalt chloride pretreated group was significantly reduced (P＜0.01), and t he expression of VEGF and iNOS in myocardium was significantly increased (P ＜0.01). Conclusions HIF_1 can reduce the acute myocardium infa rct size of rats. The protection perhaps is due to the promotion of HIF_1 on VEG F and iNOS in the myocardium.
［Key words］ Hypoxia_inducible factor 1; Myocardium protection; Acute myocardial ischemia; Rats
缺氧诱导因子_1(hypoxia_inducible factor 1, HIF_1)是哺乳动物组织细胞在缺氧/缺血条 件下产生的一种bHLH核转录因子，可以促进其下游缺氧反应基因，如血管内皮生长因子(vas cular endothelial growth factor, VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxid e synthase, iNOS)，促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)等的表达，增强组织细胞抵抗缺血缺氧的能力［1，2］。本 实验应用HIF_1活性诱导剂氯化钴预处理大鼠，预测预处理对大鼠急性心肌梗死面积和VEGF 、iNOS蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料：
(1)健康雄性3周龄SD大鼠18只，体重40～60g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心 。
(2)HIF_1α、iNOS和VEGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP_9002免疫组化试剂盒(美 国ZYMED公司)购自北京中山生物技术有限公司。氯化钴(CoCl2•6H2O)，北京红星化工 厂生产。用蒸馏水配成0.6% CoCl2溶液备用。红四氮唑(TTC)由上海第三试剂厂生产(批 号970924)，用前以0.1M.PH7.4的PBS缓冲液配成1%溶液。
（3) DH-150型小动物呼吸机，浙江医科大学医学仪器实验厂生产。Power Lab/16sp信号处 理器、生物放大器均为澳大利亚AD Instrument公司产品；联想电脑。CS501型超级恒温水浴 器，南通科学仪器厂生产。Mettler Toledo电子分析天平（型号PL303,精确度：0.001g)。
(4)图象分析软件采用华中科技大学同济医学院病理科HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文 分析系统。
1.2 方法：
（1)将试验大鼠随机分为三组：假手术组(F组，n=6)、对照组(C组，n=6)和实验组（H组，n =6）。假手术组和对照组给予腹腔注射蒸馏水（1ml/100g），回笼普通饲养24h。实验组给 予腹腔注射0.6%CoCl2溶液（60mg/kg),回笼普通饲养24h。
假手术组预处理24h后，给予3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，气管插管后接DH_150 型小动物呼吸机，按1ml/100g潮气量，60～70次／分的频率给予呼气末持续正压呼吸，呼： 吸比为2：1。从胸骨左缘3、4肋间进胸，暴露胸腔、破心包，暴露肺动脉圆锥与左心耳根部 间的左冠状静脉。以左冠状静脉为标志，用3/8圆3×10不锈钢圆针，3-0丝线在左冠状动脉 前降支下缝一针，丝线不打结。稳定约5分钟后逐层关胸。回笼普通普通饲养24h。
对照组和实验组预处理24h后，按上述同样方法，用3～0丝线在左冠状动脉前降支下缝一针 并 稳定5min后将丝线打结，以左室前壁紫绀或称蓝紫色及同步心电图示S_T段抬高、QRS幅度升 高为结扎成功标志。稳定约5分钟后逐层关胸。回笼普通普通饲养24h。
(2）检测指标：免疫组化法检测SD大鼠幼鼠心肌中HIF_1α、iNOS、VEGF的表达。以阳性染 色 面积百分比（％）显示。心梗面积测定：手术24h后，3组幼鼠均给予3%戊巴比妥钠腹腔注射 （50mg/kg）麻醉。迅速开胸取下心脏，用0.1M.pH 7.4的PBS缓冲液冲洗心脏两次，用吸 水纸吸干心脏表面PBS缓冲液，剔除心脏的心房和右室后，将左室置于-20℃冰箱。冷冻5min 后将心脏取出，平行房室沟将左室切成1.5～2mm厚共5～6片。置预温37℃、1%TTC磷酸缓冲 液 中染色约10min。坏死心肌呈白色，未坏死心肌呈红色。待色差明显后取出左室断面，置10% 甲醛溶液中固定1h。分离左室染色部分，分析天平称重，计算坏死区／左室重量百分比。同 时取部分未坏死心肌作免疫组化检测。
免疫组化检测及判断：24小时内将心脏标本常规石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水进行免疫组化 染色。
免疫组化染色步骤按试剂盒说明进行。
阳性结果判断：胞核或胞浆呈棕色颗粒染色。
定量分析：HPIAS_1000型高清晰度彩色病理图文分析系统对免疫组化切片进行图象扫描和分 析，定量计算阳性染色面积百分比。
(3)实验动物淘汰标准：术中出血超过2ml者；做手术模型过程中心率低于240次／分者；呼 吸、心跳停止超过30秒者；TTC染色，称重法检测坏死区／左室重量小于15%者。
符合上面任意一条或一条以上标准者，被淘汰出实验。随机选择另外符合要求的动物补充， 保证每组实验动物例数为6例。
1.3 统计方法：计量资料以均数士标准差（x±s）表示，组间比较用SPSS10.0软件中Least_significant difference(LSD)法检 验，P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 实验组(H组)大鼠心肌内HIF_1α、iNOS和VEGF表达量与对照组(C组)3相比明显增加 (P＜0.01)。实验组(H组)与假手术组(F组)比较无显著差异(P＞0.05)，见表1 。
2.2 实验组(H组)大鼠心梗面积与对照组(C组)相比明显减小(P＜0.01)。假手术组(F 组)大鼠心梗面积为0，见表2。
3 讨论
HIF_I是在缺血／缺氧条件下哺乳动物组织细胞产生的一种bHLH核转录因子［1,2］。HIF_1以异源二聚体形式存在，包括HIF_1α和HIF_1β两个亚基。HIF_1α是HIF_1的活性亚 基和氧调节亚基［2］，其结构中包含反式活化结构域(trans_activation domain, T AD）和氧依赖降解结构域(oxygen dependent degradation domain, ODD)前者参与转录活化 ，后者控制其常氧环境中的降解［3］。低氧／缺血／氯化钴可抑制HIF_1α蛋白降解 ，使细胞内HIF_1α蛋白迅速积累并转入核内与HIF_1β蛋白结合，形成具有转录活性的二聚 体［3］。HIF_1所调控靶基因的启动子或增强子中必须包含低氧反应元件(HRE），其 核心序列为5’_TACGTGCT_3’,而且其中必须有一个或一个以上的HIF_1结合位点。HIF_1通 过促进其下游缺氧反应基因，如VEGF、iNOS、EPO、GLUT1等的表达，广泛参与组织细胞的缺 氧反应和缺氧适应性反应，并在此过程中起关键作用［4］。
iNOS是HIF_1的潜在靶基因，HIF_1通过结合iNOS基因5’端的低氧反应元件(HRE）序列而诱 导缺氧心肌内iNOS的基因表达，而且可介导IL_1β对iNOS基因和蛋白表达诱导放大作用 ［5］。iNOS产生于心肌细胞、血管平滑肌细胞和吞噬细胞，仅在被激活后表达，增加NO 的产生。iNOS一旦表达，将与CaM牢固结合，并维持在最大活性状态，其合成的NO能持续相 对较长时间（数小时至数天）。NO属于血管内皮衍生性舒张因子(EDRF),是心血管系统最重 要的调节因子之一［6-8］。NO可以调节冠脉循环和心肌功能；扩张冠脉血管，抑制 血小板聚集和白细胞粘附。国内外大量研究表明，iNOS在心肌预处理的心肌保护作用中 扮演着扳机和介质的双重角色［9］。本实验结果表明，氯化钻预处理后大鼠心肌内i NOS蛋白表达增加，提示HIF_1可能通过增加在体心肌内iNOS蛋白表达对急性缺血心肌起到保 护作用。
VEGF编码基因是HIF_1转录活化的靶基因，在VEGF 5’端增强子内存在HRE,且包含有HIF_1的 结合位点，HIF_1可与VEGF 5'端增强子结合使VEGF的转录和表达增强。VEGF是内皮细胞特异 性的促有丝分裂原，其主要生物学功能是促进内皮细胞增殖、新生血管形成和增加血管通透 性［10，11］。本实验结果表明，氯化钻预处理后大鼠心肌内VEGF蛋白 表达增加，提示增加心肌内VEGF蛋白表达可能是HIF_1对在体急性缺血心肌的保护作用机制 之一。
综上所述，HIF_1可减少大鼠在体急性心肌梗死面积，对大鼠急性缺血心肌具有保护作用， 其机制可能与HIF_1促进心肌内iNOS和VEGF蛋白表达增加有关。HIF_1有可能成为心肌保护和 缺血性心脏病治疗的新靶点。
参考文献
［1］Wang GL, Jiang BH, Rue EA, et al. Hypoxia_inducible factor 1 is a b asic_helix_loop_helix_PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension［J］．Pro c Natl Acad Sci U S A，1995，92（12）：5510-5514．
［2］Jiang BH，Rue E，Wang GL, et al．Dimerization, DNA binding, and transactiva tion properties of hypoxia-inducible factor 1［J］．Biol Chem, 1996，271（30）： 17771-17778．
［3］Jiang BH，Zheng JZ，Leung SW, et al．Transactivation and inhibitory domains of hypoxia_inducible factor l alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension［J］．J Biol Chem，1997，272（31）：19253-19260．
［4］Bracken CP，Whitelaw ML, Peet DJ．The hypoxia- inducible factors：key trans criptional regulators of hypoxic responses［J］．Cell Mol Life Sci，2003，60(7） ：1376-1393．
［5］Jung F，Palmer LA，Zhou N, et al．Hypoxic regulation of inducible nitric ox ide synthase via hypoxia indu_cible factor_1 in cardiac myocytes［J］．Circ Res ，2000，86（3）：319-325．
［6］Jugdutt BI．Nitric oxide and cardiovascular protect_tion［J］．Heart Fail R ev, 2003，8（1）：29-34．
［7］Llorens S，Jordan J，Nava E．The nitric oxide pathway in the cardiovascular system［J］．J Physiol Biochem，2002，58(3）：179-188．
［8］Morbidelli L, Donnini S，Ziche M．Role of nitric oxide in the modulation of angiogenesis［J］．Curr Pharm Des，2003，9(7)：521-530．
［9］Xi L，Tekin D，Gursoy E, et al．Evidence that NOS2 acts as a trigger and me diator of late preconditioning induced by acute systemic hypoxia［J］．Am J Phys iol Heart Circ Physiol，2002，283（1）：H5-12．
［10］Ferrara N．Molecular and biological properties of vascular endothelial gro wth factor［J］．J Mol Med，1999，77（7）：527-543．
［11］Drake CJ，Little CD．VEGF and vascular fusion：impli_cations for normal a nd pathological vessels［J］．J Histochem Cytochem，1999，47（11）：1351-1356．
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。