【摘 要】
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目的 构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段(C99)、蓝色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp),利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至
【机 构】
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100029北京,首都医科大学附属北京安贞医院神经内科,430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,430074武汉,华中科技大学生命科学院,430030武汉,华中科技大学同济医学院
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目的 构建含有Swedish突变和Flemish突变的荧光真核表达系统,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码Flemish突变的APP最后300个碱基片段(C99)、蓝色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp),利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP-C99,并将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达;检测荧光共振能量转移(FRET),以及进行β淀粉样蛋白(Aβ)免疫细胞化学染色.结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用激光共聚焦显微镜观察转染细胞,发现融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)FRET检测发现CFP-54bp-YFP-C99可以发生β和γ裂解产生Aβ,沉积在细胞内、胞膜上以及细胞间隙;CFP-54bp-YFP不能发生β裂解.(4)免疫细胞化学染色证实Aβ在细胞膜、胞浆内以及细胞间隙聚集沉积.结论 (1)重组质粒能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)成功实现在活体细胞中观察APP裂解.(3)Aβ有可能产生于APP由胞浆至胞膜的运输过程中.(4)C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用。
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