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doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2013.21.1
摘 要 目的：采用肺癌H460细胞三维立体培养技术，直接观察全反式维甲酸对肺的主要成分之一胶原组织降解的干预作用。方法：在肺癌H460细胞三维立体培养过程中加入细胞因子（TNF-α和IL-1β）来诱导MMPs的表达，同时加入RA干预MMPs的表达；用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9，同时在培养5天后测定胶原含量大小。结果：TNF-α和IL-1β诱导培养在立体胶原内的肺癌H460细胞产生大量MMP-2和MMP-9，并促进其的活化，引起大量胶原降解（P<0.05），RA抑制了MMP-2及MMP-9的表达及活化，进而抑制了胶原的降解，对抗了细胞因子（TNF-α和IL-1β）对胶原的降解作用。结论：炎性介质（TNF-α和IL-1β）可促进MMPs的表达，肺内的胶原可以被基质金属蛋白酶分解，这一作用可以使肺癌的侵袭或转移能力得到加强；全反式维甲酸（ATRA）通过抑制MMPs的表达与活化对抗MMPs对肺组织的破坏作用，进而抑制了肺癌的侵袭与转移。
关键词 全反式维甲酸 基质金属蛋白酶三维立体培养 细胞因子 TNF-α IL-1β 非小细胞肺癌 肺癌H460细胞
最为最常见的恶性肿瘤之一，肺癌较易转移并且其转移过程复杂而连续，严重威胁人民健康和生命。影响肺癌转移的因素有很多，如癌细胞侵袭性、粘附力、基质降解、间质重构、肿瘤血管生成、微环境改变等诸多因素紧密相连。肺癌患者的死亡大多是由于其向远处脏器的转移。基质金属蛋白酶（MMPs）中与肺癌的侵袭或转移关系最为密切的要属MMP-2和MMP-9，它们可以使基膜Ⅳ型胶原分解。研究表明，炎症介质在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，其分泌的细胞因子（TNF-α和IL-1β等）能够促进体外多种细胞中MMPs的表达已被很多研究证实[1]。但细胞因子对肺癌细胞的研究较少，国内尚未见相关报道，且其作用机制仍不明。既往研究发现，全反式维甲酸（ATRA）具有抑制癌细胞增殖、诱导细胞分化的功能，近年来，针对此方面的研究发现，ATRA还可以对细胞的侵袭能力、运动性以及粘附性等造成一定的影响，这主要是通过其具有调节波形蛋白、粘附分子的能力等来转移相关蛋白[2，3]，这种能够抑制转移的作用有望在未来得到广泛应用。本实验旨在观察肺癌H460细胞在活性胶原的三维立体培养中，与肺损害相关性最强的细胞因子：TNF-α（肿瘤坏死因子）和IL-1β（白介素-1β）对MMPs的诱导作用以及ATRA对胶原降解的干预作用，进而探讨它们在非小细胞肺癌侵袭转移中所起的作用，有望发现将ATRA应用在对人类肺癌进行治疗和预防的理论依据。
资料与方法
材料：CO2培养箱、倒置显微镜、培养瓶和24孔培养板、电泳系统、蛋白质Marker、 DMEM培养基和胰酶、新生牛血清。由中国人民解放军总医院惠赠的非小细胞肺癌H460细胞株。TNF-α、IL-1β、全反式维甲酸（Sigma），DMEM（含10%新生牛血清）培养基中进行细胞均培养，条件37℃、50ml/L CO2，所用细胞均处于对数生长期。
方法：①制备胶原：从截取下来的大鼠整条尾巴中分离出胶原丝，将分离得到的胶原丝用平衡液及乙醇多次漂洗，准备工作完成后，在4℃浓度0.4mmol/L乙酸环境下进行胶原提取[4]。②立体培养细胞：将胶原、4×DMEM和灭菌水按照一定的比例进行混合均匀，形成等渗、等离子、1×DMEM的液体胶原，胶原浓度0.75g/L。肺癌H460细胞浓度4×108/L，以0.5ml/孔移入24孔培养板内，胶原固化后每孔加入DMEM培养液1ml，在37℃，50ml/L CO2条件下培养5天。本实验共分两大实验组：RA干预组与非干预组，RA非干预组又分为对照组A1（Con）、细胞因子（TNF-α）组B1、细胞因子（IL-1β）组C1和细胞因子（TNF-α+IL-1β）D1；RA干预组分为（Con+RA组）A2、（细胞因子TNF-α+RA）组B2、（细胞因子IL-1β+RA）组C2和（细胞因子TNF-α+IL-1β+RA）D1。每小组各设5个平行空。为观察MMP诱导和活化，在除对照组外的各实验组培养液中加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L），在D1、D2两实验组中分别加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L）；在ATRA干预组中均加入全反式维甲酸（1μM/L），观察在ATRA、胞因子干预与非干预情况下两者对胶原降解的干预作用。培养5天后，收集培养液和胶原。应用羟脯氨酸法来检测胶原的浓度。培养液中MMP-2和MMP-9应用明胶酶谱法来进行检测。
统计学处理：重复实验3次以上。数据来自于1次随机实验的结果，为5个培养胶原的（x±s）。运用t检验进行两组间定量资料的比较，进行多组间定量资料的比较使用方差分析。
结 果
如图1、图2明胶酶谱所示84kD为MMP-9；72kD为proMMP-2 （MMP-2酶原形式），66kD为其活化式。酶谱图1显示肺癌H460细胞在无任何干预情况下可产生proMMP-2（MMP-2酶原形式），但无MMP-9、MMP-2表达（如A1）；在细胞因子（TNF-α和IL-1β）分别作用下，proMMP-2表达增强，并出现MMP-2、MMP-9的表达（如图B1、C1），同时，当两种细胞因子共同作用时（如图D1），proMMP-2、MMP-2、MMP-9表达均增强。酶谱图2显示在全反式维甲酸（ATRA）干预下，各实验组（Con、CM）关于proMMP-2、MMP-2、MMP-9的表达均减弱。以上分析预示细胞因子（TNF-α和IL-1β）在肺癌H460细胞的三维立体培养中促进MMP-2、MMP-9的表达及活化，而RA抑制了细胞因子促进MMP-2、MMP-9表达及活化的效应。
胶原含量（μg/gel）变化：图3所示，肺癌H460细胞在胶原内立体培养5天后，在无细胞因子CM（TNF-α和IL-1β）及RA干预情况下即可出现少量胶原降解（A1：对照），胶原含量（μg/gel）35.56±1.38；在肺癌H460细胞在立体培养过程中分别在细胞因子TNF-α（B1）、IL-1β（C1）作用下，胶原含量分别为18.72±0.97、19.12±1.21，胶原含量明显减少，与无细胞因子干预时（A1）存在明显差异（P<0.05），而B1与C1见未见明显差异；当细胞因子（TNF-α和IL-1β）共同作用时（D1），胶原含量12.4±1.17，胶原含量较A1、B1、C1时胶原含量进一步减少，并存在明显差异（P<0.05）。 在RA及CM共同干预时，如图所示（CM+RA），A2（Con+RA）组胶原含量42.98±1.28，B2（TNF-α+RA）胶原含量35.92±0.88，C2（IL-1β+RA）胶原含量35.84±0.75，D2（TNF-α+IL-1β+RA）胶原含量31.32±0.60；A2、B2、C2、D2各组分别与A1、B1、C1、D1各组差异存在统计学意义（P<0.05），而B2、C2两组差异无统计学意义（P>0.05）。
以上分析提示细胞因子促进肺癌H460细胞关于MMPs的表达，进而促进胶原的降解，而全反式维甲酸（ATRA）对胶原的降解抑制效果显著（P>0.05），与此同时，它还可以使由于炎性介质导致的胶原降解速度减慢。
讨 论
肺癌的侵袭与转移是按照一个极其复杂的顺序发展的连续过程，我们只要针对肺癌侵袭和转移过程中的任何一个步骤进行适当的干预或是阻断其发展，都能够使癌细胞的转移终止在该极端不再继续发展。特异性抗转移药物是肿瘤研究的重点和热点之一。维甲酸类药物包括了维生素A的天然以及人工合成的衍生物，在对于生长发育的维持方面作用非常重大，这一作用主要表现在它不仅能够促进上皮组织的分化生长还可以维持其正常的功能。ATRA属第三代维甲酸，Lokshin A等的研究表明其可以诱导细胞的分化和凋亡，同时还能够抑制其增殖[5]，通过此次研究我们也发现ATRA除了以上功能以外还能够抑制肺癌转移。ATRA抑制转移的机制是通过减少血管生成来实现，因为ATRA可以明显抑制血管平滑肌细胞增殖，下调TGF-β基因表达，降低血纤维蛋白酶原激活物的活性，使血纤维蛋白酶原激活物抑制物PAI-1表达上调[6，7]。在Kusmartsev S等的研究结果显示[8]，ATRA与鼠肝脏星状细胞联合作用，可显著降低原胶原降解，降低肿瘤细胞的转移。
本试验采用肺癌H460细胞三维立体培养技术，对细胞以及细胞基质和细胞外基质的降解这三者之间的关系进行直接的观察，为细胞外间质组织降解破坏和组织重塑建立了理想的体外模型。
本研究表明，肺癌H460细胞单独在三维立体培养过程中自身可产生少量MMP-2，多为酶原形式（proMMP-2），无明显胶原降解；当细胞因子（TNF-α或IL-1β）分别或共同干预三维立体培养时，肺癌H460细胞产生了大量的MMP-2、MMP-9，并诱导其活化，此时胶原被大量分解，进而促进了肺癌的侵袭与转移；而RA明显抑制了肺癌H460细胞关于MMPS的表达及活化，削弱了细胞因子对胶原的降解作用，进而对肺癌的侵袭与转移起到抑制作用。在本实验中预示细胞因子可通过诱导肺癌细胞关于基质金属蛋白酶（MMPs）的表达及活化，进而促进胶原的降解，最终促进了肺癌的侵袭与转移，而全反式维甲酸却削弱了炎性介质的这种作用，进而抑制了肺癌的侵袭与转移。但这种促进或抑制肺癌侵袭与转移的机制仍需进一步研究。
参考文献
1 Zhu YK，Sko ld CM，L iu XD，et al.Fibroblasts and monocyte macrophages contract and degrade three- dimension al collagen gels inextended co-culture[J].Respiratory Res，2001，2（5）：295-299.
2 Y oonWH，Song IS，Lee BH，et al.Differential regulation of vimentin mRNA by 12-O-tetradecanoylphorbol 13-etate and alltrans-retinoic acid correlatesw ithm otility of Hep 3B hum an h epatocellular carcinoma cells[J].Cancer Lett，2004，203（1）：99-105.
3 Wu Q，Chen YQ，Chen ZM，et al.Effects of retinoic acid onm etastasis and its related proteins in gastric cancer cells in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacol S in，2002，23（9）：835-841.
4 Mio TY，Adachi DJ，Romberger RF，et al.Regulation of fibroblast proliferation in three dimensional collagen gel matrix[J].In Vitro Cell Dev Biol，1996，32（7）：427-433.
5 Lokshin A，Zhang H，Mayotte J，et al.Early effects of retinoic acid on proliferation，differentiation and apoptosis in nonsmall cell lung cancer cell lines[J].Anticancer Res，1999，19：5251-5254.
6 Watanabe A，Kanai H，Arai M，et al.Retinoids induce the PAI-1 gene expression through tyrosine kinase- dependent pathways in vascular smoot h muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmacol，2002，39（4）：503-512.
7 Johst U，Bet SA，Wiskirchen J，et al.All-Trans and 9-cis retinoid acids inhibit proliferation，migration，and synt hesis of extracellular matrix of human vascular smooth muscle cells by inducing differentiation[J].J Cardiovasc Pharmacol，2003，41（4）：526-535.
8 Kusmartsev S，Cheng F，Yu B，et al.All-trans-retinoic acid eliminates immature myeloid cells from tumor-bearing mice and Improves the effect of vaccination[J].Cancer Res，2003，63（15）：4441-4449.
摘 要 目的：采用肺癌H460细胞三维立体培养技术，直接观察全反式维甲酸对肺的主要成分之一胶原组织降解的干预作用。方法：在肺癌H460细胞三维立体培养过程中加入细胞因子（TNF-α和IL-1β）来诱导MMPs的表达，同时加入RA干预MMPs的表达；用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9，同时在培养5天后测定胶原含量大小。结果：TNF-α和IL-1β诱导培养在立体胶原内的肺癌H460细胞产生大量MMP-2和MMP-9，并促进其的活化，引起大量胶原降解（P<0.05），RA抑制了MMP-2及MMP-9的表达及活化，进而抑制了胶原的降解，对抗了细胞因子（TNF-α和IL-1β）对胶原的降解作用。结论：炎性介质（TNF-α和IL-1β）可促进MMPs的表达，肺内的胶原可以被基质金属蛋白酶分解，这一作用可以使肺癌的侵袭或转移能力得到加强；全反式维甲酸（ATRA）通过抑制MMPs的表达与活化对抗MMPs对肺组织的破坏作用，进而抑制了肺癌的侵袭与转移。
关键词 全反式维甲酸 基质金属蛋白酶三维立体培养 细胞因子 TNF-α IL-1β 非小细胞肺癌 肺癌H460细胞
最为最常见的恶性肿瘤之一，肺癌较易转移并且其转移过程复杂而连续，严重威胁人民健康和生命。影响肺癌转移的因素有很多，如癌细胞侵袭性、粘附力、基质降解、间质重构、肿瘤血管生成、微环境改变等诸多因素紧密相连。肺癌患者的死亡大多是由于其向远处脏器的转移。基质金属蛋白酶（MMPs）中与肺癌的侵袭或转移关系最为密切的要属MMP-2和MMP-9，它们可以使基膜Ⅳ型胶原分解。研究表明，炎症介质在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，其分泌的细胞因子（TNF-α和IL-1β等）能够促进体外多种细胞中MMPs的表达已被很多研究证实[1]。但细胞因子对肺癌细胞的研究较少，国内尚未见相关报道，且其作用机制仍不明。既往研究发现，全反式维甲酸（ATRA）具有抑制癌细胞增殖、诱导细胞分化的功能，近年来，针对此方面的研究发现，ATRA还可以对细胞的侵袭能力、运动性以及粘附性等造成一定的影响，这主要是通过其具有调节波形蛋白、粘附分子的能力等来转移相关蛋白[2，3]，这种能够抑制转移的作用有望在未来得到广泛应用。本实验旨在观察肺癌H460细胞在活性胶原的三维立体培养中，与肺损害相关性最强的细胞因子：TNF-α（肿瘤坏死因子）和IL-1β（白介素-1β）对MMPs的诱导作用以及ATRA对胶原降解的干预作用，进而探讨它们在非小细胞肺癌侵袭转移中所起的作用，有望发现将ATRA应用在对人类肺癌进行治疗和预防的理论依据。
资料与方法
材料：CO2培养箱、倒置显微镜、培养瓶和24孔培养板、电泳系统、蛋白质Marker、 DMEM培养基和胰酶、新生牛血清。由中国人民解放军总医院惠赠的非小细胞肺癌H460细胞株。TNF-α、IL-1β、全反式维甲酸（Sigma），DMEM（含10%新生牛血清）培养基中进行细胞均培养，条件37℃、50ml/L CO2，所用细胞均处于对数生长期。
方法：①制备胶原：从截取下来的大鼠整条尾巴中分离出胶原丝，将分离得到的胶原丝用平衡液及乙醇多次漂洗，准备工作完成后，在4℃浓度0.4mmol/L乙酸环境下进行胶原提取[4]。②立体培养细胞：将胶原、4×DMEM和灭菌水按照一定的比例进行混合均匀，形成等渗、等离子、1×DMEM的液体胶原，胶原浓度0.75g/L。肺癌H460细胞浓度4×108/L，以0.5ml/孔移入24孔培养板内，胶原固化后每孔加入DMEM培养液1ml，在37℃，50ml/L CO2条件下培养5天。本实验共分两大实验组：RA干预组与非干预组，RA非干预组又分为对照组A1（Con）、细胞因子（TNF-α）组B1、细胞因子（IL-1β）组C1和细胞因子（TNF-α+IL-1β）D1；RA干预组分为（Con+RA组）A2、（细胞因子TNF-α+RA）组B2、（细胞因子IL-1β+RA）组C2和（细胞因子TNF-α+IL-1β+RA）D1。每小组各设5个平行空。为观察MMP诱导和活化，在除对照组外的各实验组培养液中加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L），在D1、D2两实验组中分别加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L）；在ATRA干预组中均加入全反式维甲酸（1μM/L），观察在ATRA、胞因子干预与非干预情况下两者对胶原降解的干预作用。培养5天后，收集培养液和胶原。应用羟脯氨酸法来检测胶原的浓度。培养液中MMP-2和MMP-9应用明胶酶谱法来进行检测。
统计学处理：重复实验3次以上。数据来自于1次随机实验的结果，为5个培养胶原的（x±s）。运用t检验进行两组间定量资料的比较，进行多组间定量资料的比较使用方差分析。
结 果
如图1、图2明胶酶谱所示84kD为MMP-9；72kD为proMMP-2 （MMP-2酶原形式），66kD为其活化式。酶谱图1显示肺癌H460细胞在无任何干预情况下可产生proMMP-2（MMP-2酶原形式），但无MMP-9、MMP-2表达（如A1）；在细胞因子（TNF-α和IL-1β）分别作用下，proMMP-2表达增强，并出现MMP-2、MMP-9的表达（如图B1、C1），同时，当两种细胞因子共同作用时（如图D1），proMMP-2、MMP-2、MMP-9表达均增强。酶谱图2显示在全反式维甲酸（ATRA）干预下，各实验组（Con、CM）关于proMMP-2、MMP-2、MMP-9的表达均减弱。以上分析预示细胞因子（TNF-α和IL-1β）在肺癌H460细胞的三维立体培养中促进MMP-2、MMP-9的表达及活化，而RA抑制了细胞因子促进MMP-2、MMP-9表达及活化的效应。
胶原含量（μg/gel）变化：图3所示，肺癌H460细胞在胶原内立体培养5天后，在无细胞因子CM（TNF-α和IL-1β）及RA干预情况下即可出现少量胶原降解（A1：对照），胶原含量（μg/gel）35.56±1.38；在肺癌H460细胞在立体培养过程中分别在细胞因子TNF-α（B1）、IL-1β（C1）作用下，胶原含量分别为18.72±0.97、19.12±1.21，胶原含量明显减少，与无细胞因子干预时（A1）存在明显差异（P<0.05），而B1与C1见未见明显差异；当细胞因子（TNF-α和IL-1β）共同作用时（D1），胶原含量12.4±1.17，胶原含量较A1、B1、C1时胶原含量进一步减少，并存在明显差异（P<0.05）。 在RA及CM共同干预时，如图所示（CM+RA），A2（Con+RA）组胶原含量42.98±1.28，B2（TNF-α+RA）胶原含量35.92±0.88，C2（IL-1β+RA）胶原含量35.84±0.75，D2（TNF-α+IL-1β+RA）胶原含量31.32±0.60；A2、B2、C2、D2各组分别与A1、B1、C1、D1各组差异存在统计学意义（P<0.05），而B2、C2两组差异无统计学意义（P>0.05）。
以上分析提示细胞因子促进肺癌H460细胞关于MMPs的表达，进而促进胶原的降解，而全反式维甲酸（ATRA）对胶原的降解抑制效果显著（P>0.05），与此同时，它还可以使由于炎性介质导致的胶原降解速度减慢。
讨 论
肺癌的侵袭与转移是按照一个极其复杂的顺序发展的连续过程，我们只要针对肺癌侵袭和转移过程中的任何一个步骤进行适当的干预或是阻断其发展，都能够使癌细胞的转移终止在该极端不再继续发展。特异性抗转移药物是肿瘤研究的重点和热点之一。维甲酸类药物包括了维生素A的天然以及人工合成的衍生物，在对于生长发育的维持方面作用非常重大，这一作用主要表现在它不仅能够促进上皮组织的分化生长还可以维持其正常的功能。ATRA属第三代维甲酸，Lokshin A等的研究表明其可以诱导细胞的分化和凋亡，同时还能够抑制其增殖[5]，通过此次研究我们也发现ATRA除了以上功能以外还能够抑制肺癌转移。ATRA抑制转移的机制是通过减少血管生成来实现，因为ATRA可以明显抑制血管平滑肌细胞增殖，下调TGF-β基因表达，降低血纤维蛋白酶原激活物的活性，使血纤维蛋白酶原激活物抑制物PAI-1表达上调[6，7]。在Kusmartsev S等的研究结果显示[8]，ATRA与鼠肝脏星状细胞联合作用，可显著降低原胶原降解，降低肿瘤细胞的转移。
本试验采用肺癌H460细胞三维立体培养技术，对细胞以及细胞基质和细胞外基质的降解这三者之间的关系进行直接的观察，为细胞外间质组织降解破坏和组织重塑建立了理想的体外模型。
本研究表明，肺癌H460细胞单独在三维立体培养过程中自身可产生少量MMP-2，多为酶原形式（proMMP-2），无明显胶原降解；当细胞因子（TNF-α或IL-1β）分别或共同干预三维立体培养时，肺癌H460细胞产生了大量的MMP-2、MMP-9，并诱导其活化，此时胶原被大量分解，进而促进了肺癌的侵袭与转移；而RA明显抑制了肺癌H460细胞关于MMPS的表达及活化，削弱了细胞因子对胶原的降解作用，进而对肺癌的侵袭与转移起到抑制作用。在本实验中预示细胞因子可通过诱导肺癌细胞关于基质金属蛋白酶（MMPs）的表达及活化，进而促进胶原的降解，最终促进了肺癌的侵袭与转移，而全反式维甲酸却削弱了炎性介质的这种作用，进而抑制了肺癌的侵袭与转移。但这种促进或抑制肺癌侵袭与转移的机制仍需进一步研究。
参考文献
1 Zhu YK，Sko ld CM，L iu XD，et al.Fibroblasts and monocyte macrophages contract and degrade three- dimension al collagen gels inextended co-culture[J].Respiratory Res，2001，2（5）：295-299.
2 Y oonWH，Song IS，Lee BH，et al.Differential regulation of vimentin mRNA by 12-O-tetradecanoylphorbol 13-etate and alltrans-retinoic acid correlatesw ithm otility of Hep 3B hum an h epatocellular carcinoma cells[J].Cancer Lett，2004，203（1）：99-105.
3 Wu Q，Chen YQ，Chen ZM，et al.Effects of retinoic acid onm etastasis and its related proteins in gastric cancer cells in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacol S in，2002，23（9）：835-841.
4 Mio TY，Adachi DJ，Romberger RF，et al.Regulation of fibroblast proliferation in three dimensional collagen gel matrix[J].In Vitro Cell Dev Biol，1996，32（7）：427-433.
5 Lokshin A，Zhang H，Mayotte J，et al.Early effects of retinoic acid on proliferation，differentiation and apoptosis in nonsmall cell lung cancer cell lines[J].Anticancer Res，1999，19：5251-5254.
6 Watanabe A，Kanai H，Arai M，et al.Retinoids induce the PAI-1 gene expression through tyrosine kinase- dependent pathways in vascular smoot h muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmacol，2002，39（4）：503-512.
7 Johst U，Bet SA，Wiskirchen J，et al.All-Trans and 9-cis retinoid acids inhibit proliferation，migration，and synt hesis of extracellular matrix of human vascular smooth muscle cells by inducing differentiation[J].J Cardiovasc Pharmacol，2003，41（4）：526-535.
8 Kusmartsev S，Cheng F，Yu B，et al.All-trans-retinoic acid eliminates immature myeloid cells from tumor-bearing mice and Improves the effect of vaccination[J].Cancer Res，2003，63（15）：4441-4449.